背景:心跳驟停(cardiac arrest,CA)是指心臟泵血功能的陡然停止,是嚴(yán)重危害人類健康與生存的急危重癥之一。據(jù)統(tǒng)計,在我國每年超過50萬人發(fā)生CA。CA后腦損傷是導(dǎo)致患者后期死亡的重要原因。自噬(autophagy)是指細(xì)胞內(nèi)的長壽命蛋白質(zhì)以及受損的細(xì)胞器經(jīng)溶酶體途徑被降解的過程,廣泛參與生長發(fā)育、免疫、新陳代謝和老化等生理性過程,普遍存在于真核細(xì)胞中。近期研究表明自噬過度激活可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是心跳驟停心肺復(fù)蘇后大腦的主要病理變化。遠(yuǎn)程缺血處理是在遠(yuǎn)端器官或部位進(jìn)行短暫的、非致死性缺血和再灌注的處理方式。研究表明遠(yuǎn)程缺血后處理可改善心肺復(fù)蘇后的神經(jīng)功能障礙,其保護(hù)機(jī)制與自噬的關(guān)系有待深入研究。目的:探討遠(yuǎn)程缺血后處理對大鼠心肺復(fù)蘇后海馬神經(jīng)元自噬和凋亡的影響及其機(jī)制。方法:①選用雄性SD大鼠通過誘導(dǎo)窒息建立心跳驟停心肺復(fù)蘇后腦損傷模型。②30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組,n=6)、心跳驟停心肺復(fù)蘇組(CA/CPR組,n=24),CA/CPR組分別于自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后3h、6h、24h、72h處死大鼠取腦海馬組織,用Western blot法檢測與自噬活性有關(guān)的LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白和與線粒體自噬活性有關(guān)的Parkin蛋白表達(dá),免疫熒光法檢測LC3在神經(jīng)元細(xì)胞的定位,透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞自噬小體的形成和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。③50只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組(Sham組)、心跳驟停心肺復(fù)蘇組(CA/CPR組)、遠(yuǎn)程缺血后處理組(RIPostC組),以ROSC后24h為實驗終點。遠(yuǎn)程缺血后處理是指在成功復(fù)蘇后立即用動脈夾夾閉左側(cè)股動脈5min,釋放5min,重復(fù)3個循環(huán)。在自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后不同時間點對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分(NDS),Western blot法檢測LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)、Parkin和P53線粒體轉(zhuǎn)位情況,用TUNEL法檢測海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,免疫熒光法檢測LC3在神經(jīng)元細(xì)胞的定位,免疫熒光雙標(biāo)法檢測線粒體P53的表達(dá),透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元細(xì)胞自噬小體的形成和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果:①心跳驟停大鼠自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后6h、24h、72h腦海馬神經(jīng)元細(xì)胞LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、線粒體Parkin表達(dá)與Sham組比較,均明顯增高(P0.05),ROSC后24h蛋白表達(dá)量處于峰值,復(fù)蘇后腦組織免疫熒光吸光度值較Sham組升高(P0.05)。②與CA/CPR組相比,RIPostC組大鼠復(fù)蘇后NDS評分升高,海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1蛋白表達(dá)下降,線粒體Parkin和P53轉(zhuǎn)位減少,神經(jīng)元細(xì)胞自噬泡減少,線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷減少。結(jié)論:本研究結(jié)果表明大鼠心跳驟停后5min開始心肺復(fù)蘇可建立穩(wěn)定的復(fù)蘇后腦損傷模型。ROSC后6h海馬神經(jīng)元細(xì)胞自噬活性增強(qiáng),自噬(包括線粒體自噬)水平呈現(xiàn)先升后降的趨勢,于復(fù)蘇后24h處于峰值,72h仍處于激活狀態(tài)。遠(yuǎn)程缺血后處理可改善大鼠心肺復(fù)蘇后的神經(jīng)功能,這可能與抑制神經(jīng)元細(xì)胞過度自噬(包括線粒體自噬)和P53線粒體轉(zhuǎn)位誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

??核固縮、裂解嚴(yán)重（圖１－１Ｂ）。??１．４．４兩組大鼠腦海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較??為進(jìn)一步證明模型是否成功，本部分檢測了兩組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情??況。如圖１－２所示，熒光染色后，正常的細(xì)胞核顯藍(lán)色，而ＴＵＮＥＬ陽性的細(xì)胞核呈粉??紅色。Ｓｈａｍ組凋亡細(xì)胞較少，凋亡率為（１．６８±０．?７６）?％；?ＣＡ／ＣＰＲ組凋亡細(xì)胞較??多，凋亡率為（１７．?７１±６．?７５）?％?；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．?０５）。詳見圖１－２。??表１－２兩組大鼠復(fù)蘇后不同時間點ＮＤＳ評分??Ｔａｂｌｅ?１?－２?ＮＤＳ?ｓｃｏｒｅｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??組別?２４ｈ?４８ｈ?７２ｈ??Ｓｈａｍ?組?７９．４±０．９?８０．０±０．０?８０．０±０．０??ＣＡ／ＣＰＲ?組?５丨．１?±２．９＊?５５．７土３．０＊?５９．４±２．５＊??注：與Ｓｈａｍ組相比，卞＜０．０５??ｌ＇?＊?＊?＂?１?．．??？?．?ｍ?？?？??ｒ?？?０?．?－?＊?？??ｔ??？?■?Ｖ?？?％?＊?＜??．?．．?．ｆ．．?Ｉ??？、?（?＼?｜?｜??ｆ?Ｊ?＿?Ｉ??＇、？?？?ｒ?？?？?？?‘?．?？，?’?．?？?？二＇?４?，?＇??？?？?：?％??Ａ?Ｗｉ?Ｂ．－．?；，??圖１－１復(fù)蘇后２

??核固縮、裂解嚴(yán)重（圖１－１Ｂ）。??１．４．４兩組大鼠腦海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較??為進(jìn)一步證明模型是否成功，本部分檢測了兩組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情??況。如圖１－２所示，熒光染色后，正常的細(xì)胞核顯藍(lán)色，而ＴＵＮＥＬ陽性的細(xì)胞核呈粉??紅色。Ｓｈａｍ組凋亡細(xì)胞較少，凋亡率為（１．６８±０．?７６）?％；?ＣＡ／ＣＰＲ組凋亡細(xì)胞較??多，凋亡率為（１７．?７１±６．?７５）?％?；差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Ｐ＜０．?０５）。詳見圖１－２。??表１－２兩組大鼠復(fù)蘇后不同時間點ＮＤＳ評分??Ｔａｂｌｅ?１?－２?ＮＤＳ?ｓｃｏｒｅｓ?ａｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｍｅ?ｐｏｉｎｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｔｗｏ?ｇｒｏｕｐｓ?ｏｆ?ｒａｔｓ??組別?２４ｈ?４８ｈ?７２ｈ??Ｓｈａｍ?組?７９．４±０．９?８０．０±０．０?８０．０±０．０??ＣＡ／ＣＰＲ?組?５丨．１?±２．９＊?５５．７土３．０＊?５９．４±２．５＊??注：與Ｓｈａｍ組相比，卞＜０．０５??ｌ＇?＊?＊?＂?１?．．??？?．?ｍ?？?？??ｒ?？?０?．?－?＊?？??ｔ??？?■?Ｖ?？?％?＊?＜??．?．．?．ｆ．．?Ｉ??？、?（?＼?｜?｜??ｆ?Ｊ?＿?Ｉ??＇、？?？?ｒ?？?？?？?‘?．?？，?’?．?？?？二＇?４?，?＇??？?？?：?％??Ａ?Ｗｉ?Ｂ．－．?；，??圖１－１復(fù)蘇后２

缺氧等損傷狀況導(dǎo)致線粒體出現(xiàn)氧化應(yīng)激和功能喪失時，ＰＩＮＫ１轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，聚集于線??粒體外膜，使Ｐａｒｋｉｎ蛋白磷酸化并轉(zhuǎn)位至受損線粒體，這一過程使Ｅ３泛素鏈接酶??被激活，從而激活隨后的線粒體自噬過程［１６＇１７１?（如圖２－２）。??Ｐ５３是一種廣為人知的抑癌基因，由１１個外顯子和１０個內(nèi)含子構(gòu)成，位于人類??１７號染色體上，由轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、寡聚結(jié)構(gòu)域、ＤＮＡ結(jié)合域和非ＤＮＡ結(jié)合域組??成，編碼９３個氨基酸，分子量為５３ｋＤａ的核內(nèi)磷酸化蛋白。Ｐ５３蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞信??號途徑可參與多種細(xì)胞生命活動，如調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和壞死等??正常細(xì)胞代謝過程近期有研究表明Ｐ５３能同時參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬過程??［２°］。Ｐ５３調(diào)控的細(xì)胞凋亡主要包括Ｐ５３轉(zhuǎn)錄依賴性和Ｐ５３非轉(zhuǎn)錄依賴性［２１］，其中??Ｐ５３非轉(zhuǎn)錄依賴性的細(xì)胞凋亡主要是指細(xì)胞質(zhì)中的Ｐ５３在凋亡刺激作用下，轉(zhuǎn)位至受??損的線粒體，造成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，使細(xì)胞色素Ｃ從線粒體釋放入細(xì)??胞質(zhì)
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