目的:分別檢測成人、嬰兒和低齡狒狒RBCs和PBMCs表面Gal,Neu5Gc和Sda抗原及其血清中相關(guān)抗體的表達,以及心臟手術(shù)對嬰兒體內(nèi)相關(guān)抗體的影響,探討低齡狒狒作為TKO豬-嬰兒異種心臟移植實驗模型的可能性,并為轉(zhuǎn)基因豬心臟移植給嬰兒提供實驗依據(jù)。材料與方法:材料:40份健康成人血清來自美國自愿捐獻者;84份術(shù)前先心病患兒(非暴露組)及25份術(shù)后先心病患兒(暴露組)血清由阿拉巴馬大學伯明翰分校兒科醫(yī)院提供;40份狒狒的血清及不同基因型豬全血由美國Revivicor公司提供。方法:(1)FCM檢測Gal、Neu5Gc、Sda抗原在人類、狒狒及不同基因型豬RBCs、PBMCs上的表達;(2)FCM檢測成人、非暴露組嬰兒及低齡狒狒血清IgM和IgG與WT、TKO豬RBCs的結(jié)合;(3)FCM檢測成人、非暴露組嬰兒血清IgM和IgG與TKO豬CD3+T細胞(來自血PBMC)結(jié)合:(4)FCM檢測非暴露組和暴露組嬰兒血清IgM和IgG與WT、TKO豬RBCs以及CD3+T細胞的結(jié)合;(5)FCM檢測WT、TKO PBMC與成人和嬰兒(包括非暴露組和暴露組)CDC。結(jié)果:(1)FCM檢測Gal、Neu5Gc、Sda抗原在人類、狒狒及轉(zhuǎn)基因豬RBCs、PBMCs上的表達:(1)人類在RBCs和PBMCs上不表達Gal,Neu5Gc和Sda抗原;(2)狒狒在RBCs和PBMCs上表達Neu5Gc,不表達Gal和Sda抗原;(3)WT豬表達Gal、Neu5Gc和Sda三種抗原;敲除Gal、Neu5Gc和Sda三基因的TKO豬相應(yīng)抗原不表達。(2)FCM檢測成人、非暴露組嬰兒及低齡狒狒血清IgM和IgG與WT、TKO豬RBCs結(jié)合:(1)非暴露組嬰兒:IgM與WT RBCs53%呈陽性,IgG78%呈陽性;IgM與TKO RBCs呈陰性,IgG與TKO RBCs 1%呈弱陽性;(2)成人組:IgM/IgG與WT RBCs100%陽性;IgM與TKO RBCs 5%陽性、IgG呈陰性;(3)低齡狒狒組:IgM和IgG與WT RBCs100%呈陽性;IgM與TKO RBCs 95%呈陽性,IgG 45%呈陽性;(3)FCM檢測成人、非暴露組嬰兒IgM和IgG與TKO豬CD3+T細胞結(jié)合:成人組(IgM:1.031±0.06;IgG:0.89±0.12)和嬰兒組(IgM:1.096±0.05;IgG:1.096±0.05)IgM和IgG的結(jié)合沒有顯著性差異(p0.05),并且與陰性對照組(IgM:1.094±0.07;IgG:0.89±0.03)沒有顯著性差異(p0.05)(除了成人血清IgM稍低于陰性對照(p0.05))。(4)FCM檢測非暴露組嬰兒及暴露組嬰兒血清IgM和IgG與WT、TKO豬RBCs和CD3+T細胞結(jié)合:(1)與WT RBCs,非暴露組:50%IgM陽性,76%IgG陽性。暴露組:100%IgM陽性,96%IgG陽性。暴露組IgM和IgG的結(jié)合顯著性高于非暴露組(p0.05);(2)TKO RBCs:非暴露組:0%IgM陽性,2%IgG陽性。暴露組:4%IgM陽性,4%IgG陽性。盡管暴露組IgM結(jié)合顯著高于非暴露組(p0.05),但僅有一份暴露組血清呈弱陽性;IgG結(jié)合在兩組之間沒有顯著性差異(p0.05);(3)與TKO CD3+T細胞結(jié)合,非暴露組:22%IgM陽性,58%IgG陽性。暴露組:11%IgM陽性,8%IgG陽性。暴露組和非暴露組IgM和IgG沒有顯著差別(p0.05)。(5)WT和TKO PBMCs與成人及嬰兒血清共孵育,加入兔補體,分別測量成人、嬰兒血清CDC:(1)WT豬PBMC中,成人血清細胞毒反應(yīng)(100%陽性)顯著高于非暴露組嬰兒(50%陽性)(p0.05)及陰性對照組(p0.05)。然而在TKO豬PBMC中,成人血清細胞毒反應(yīng)(15%陽性)明顯降低,稍低于陰性對照組(p0.05);嬰兒非暴露組血清的細胞毒反應(yīng)(40%陽性)與成人及陰性對照組均沒有顯著差異(p0.05)。(2)與WT豬PBMC結(jié)合,暴露組血清的細胞毒反應(yīng)(100%陽性)顯著高于非暴露組(67%陽性)(p0.05),然而在TKO PBMC中,暴露組血清(64%陽性)與非暴露組血清的細胞毒反應(yīng)(40%陽性)沒有顯著差異(p0.05)。結(jié)論:(1)人類不表達Gal,Neu5Gc和Sda抗原,但存在相應(yīng)抗體,嬰兒抗體水平較低;低齡狒狒表達Neu5Gc,不表達Gal和Sda抗原,存在Gal和Sda抗體,水平較高;WT豬表達Gal、Neu5Gc和Sda三種抗原;敲除Gal、Neu5Gc和Sda三基因的TKO豬不表達相應(yīng)抗原。(2)移植前的心臟手術(shù)不會升高嬰兒體內(nèi)的抗Gal/Neu5Gc/Sda(抗TKO)抗體水平;由于預先形成的抗TKO抗體水平低,TKO豬器官/組織/細胞移植給嬰兒可能是可行的。(3)低齡狒狒體內(nèi)抗Gal/Neu5Gc/Sda(抗TKO)抗體的水平顯著高于嬰兒,因此,不適合作為豬-嬰兒異種心臟移植模型受體。
【學位單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R446.6;R726.5
【部分圖文】：

WT 豬 RBC（A）和 PBMC(B)上表達 GO/β4GalNT2KO 豬細胞不表達 Gal，Neu5Gc 和s人I-B4al)u5GcAa)WTI-B4GTKO/CMAHKO/β4GalNT2KOCs人 WTGTKO/CMAHKO/β4GalNT2KO狒狒狒狒

圖 3.12 10 名接受過 1 期 Norwood 手術(shù)嬰兒的亞組線表示陽性抗體結(jié)合（IgM> 1.20; IgG> 1.1）。在 10 名接受過 1 期 Norwood 手術(shù)的嬰兒的亞組中，抗 TKO IgM 或 IgG 結(jié)合沒有增加。**naive0-12mexposed0-12m0204060100150200250RelatievGMW T Ig M1.2(26/50) (25/25)Anaive0-12mexposed0-12m0204060100150200250W T Ig GRelatievGM1.1**(38/50) (24/25)B2.02.5TKO IgMiveGM**C2.02.5T K O Ig GevGM**D

74圖 1：天然未經(jīng)處理的狒狒，非致敏的狒狒和致敏的狒狒血清 IgM（上圖）和 IgG（下圖）與PBMC 結(jié)合流式細胞術(shù)檢測天然未經(jīng)處理的狒狒（n = 8），非致敏的狒狒（n = 4）和致敏的狒狒（n = 4）血清 IgM（上圖）和 IgG（下圖）與（A）GTKO/CD46 豬和（B）狒狒的 CD3+T 細胞（來自 PBMC）的結(jié)合。盡管致敏的狒狒血清顯示與 GTKO/CD46 豬PBMC 結(jié)合顯著高的 IgM 和 IgG 抗體，但沒有增加與狒狒 PBMC 的的結(jié)合的 IgM 和IgG 抗體（NS=不顯著;*P<0.05）
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本文編號：2851733