前言膿毒癥(sepsis)是由感染所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征,重癥膿毒癥及膿毒性休克的年發(fā)病率在逐步上升,病死率接近50%。膿毒癥心肌抑制的特征為收縮功能損害,心臟擴(kuò)大、射血分?jǐn)?shù)下降、對(duì)容量負(fù)荷收縮反應(yīng)差、收縮峰值壓力/收縮末期容積比值下降等,心肌抑制造成的心功能不全或衰竭在重癥膿毒癥非常常見(jiàn),心功能衰竭程度與疾病嚴(yán)重度及病死率密切相關(guān)。然而,膿毒癥心肌抑制的病理生理機(jī)制并不十分明了,與嚴(yán)重心肌缺血缺氧或嚴(yán)重心肌病變導(dǎo)致的心功能障礙不同,膿毒性心肌功能障礙通常沒(méi)有嚴(yán)重心肌壞死,推測(cè)膿毒性心功能障礙以功能性、一過(guò)性改變?yōu)橹?而明確膿毒癥一過(guò)性心肌抑制的病理生理機(jī)制有助于臨床醫(yī)生找到新的治療靶點(diǎn),降低危重病人的病死率。β-腎上腺素能受體(β-AR)是調(diào)節(jié)心臟功能的重要物質(zhì),重癥膿毒癥及膿毒性休克時(shí)心肌抑制的發(fā)生發(fā)展與β-AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)變化密切相關(guān)。正常情況下,心臟β1-AR的表達(dá)量約為70%~80%,β2-AR為20%~30%,β3-AR相對(duì)較少,而在病理狀態(tài)下(如衰竭心臟),三種受體密度有明顯改變,研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血和擴(kuò)張心肌病患者的心室肌中β3-AR的蛋白表達(dá)量出現(xiàn)了上升現(xiàn)象,在其他病理狀態(tài)下心臟β3-AR也出現(xiàn)了高表達(dá)。β3-AR激活需要比β1-AR和β2-AR激活濃度更高的兒茶酚胺量,病理狀態(tài)下可能是由于組織或循環(huán)中的高兒茶酚胺水平激活了β3-AR,使其水平上調(diào),重癥膿毒癥及膿毒性休克病人血清中兒茶酚胺濃度明顯增高,這其中除了病人自身產(chǎn)生的內(nèi)源性兒茶酚胺外,作為治療干預(yù),外源性兒茶酚胺的輸入可以使腎上腺素或去甲腎上腺素成倍的升高。然而β3-AR的增加在膿毒癥心肌抑制中到底扮演了何種角色,是對(duì)兒茶酚胺濃度過(guò)高的代償性保護(hù)反應(yīng)還是膿毒癥心肌抑制的促進(jìn)因子目前尚不清楚。無(wú)論在心肌細(xì)胞水平還是大體心臟水平,許多研究都已證明激動(dòng)β3-AR會(huì)產(chǎn)生負(fù)性肌力作用,此作用通過(guò)激活抑制性G蛋白(Gi蛋白),繼而增加一氧化氮(NO)釋放而實(shí)現(xiàn),NOS/NO-cGMP-PKG可能是β3-AR的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,且與其抑制L型鈣通道及細(xì)胞內(nèi)鈣瞬變的幅度有關(guān)。現(xiàn)已證實(shí)心臟中有三種NOS亞型,內(nèi)皮型NOS(eNOS,NOS3),神經(jīng)元型NOS(nNOS,NOS1)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS,NOS2)。NOS3和NOS1在心臟功能性地表達(dá),而NOS2在病理狀態(tài)下才有表達(dá)。研究顯示三種NOS亞型均在β3-AR介導(dǎo)的心臟疾病中發(fā)揮了作用,但究竟哪一種亞型的NOS在膿毒癥心肌抑制中發(fā)揮主要作用,且其與β3-AR的關(guān)系尚不明確。本研究以LPS致膿毒性休克大鼠(大體、單個(gè)細(xì)胞)及LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞為對(duì)象,觀察心肌抑制產(chǎn)生的情況,并以心肌抑制發(fā)生為時(shí)間點(diǎn),大體水平動(dòng)態(tài)檢測(cè)β1、2、3-AR及各亞型NOS的變化(蛋白、mRNA水平),根據(jù)大體結(jié)果檢測(cè)原代細(xì)胞水平β3-AR及主亞型NOS的變化(蛋白、mRNA水平),并在原代細(xì)胞水平通過(guò)β3-AR激動(dòng)劑及NOS抑制劑初步探討β3-AR在LPS致心肌抑制的作用機(jī)制,為β3-AR及其相關(guān)通路在膿毒性休克中的作用及機(jī)制打下基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)材料及方法一、動(dòng)物模型制備及分組1.大鼠膿毒性休克模型建立本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)毒素靜脈給藥的方法建立大鼠膿毒癥模型。20%烏拉坦溶液5ml/kg腹腔注射麻醉大鼠,剪開左側(cè)腹股溝皮膚,逐層鈍性分離組織及肌肉,暴露左側(cè)股動(dòng)脈并置管,通過(guò)三通頭與Biopac多導(dǎo)電生理記錄儀壓力換能器連接(預(yù)先排凈管路內(nèi)所有氣泡),用于連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP);同法右側(cè)暴露股靜脈,用于經(jīng)股靜脈給藥,待大鼠左心室插管成功穩(wěn)定15min后泵入LPS 15mg/kg(溶于3ml/kg液體),泵速為0.1ml/min,當(dāng)MAP較基礎(chǔ)值降低25-30%時(shí)視為膿毒性休克。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組⑴確定膿毒性休克時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)分組:按隨機(jī)數(shù)字表法把Wistar大鼠分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組,每組10只動(dòng)物,對(duì)照組給予股靜脈泵入生理鹽水3ml/kg,泵速同前。兩組大鼠均在體連續(xù)監(jiān)測(cè)心功能6h。⑵用于標(biāo)本收集實(shí)驗(yàn):按隨機(jī)數(shù)字表法把Wistar大鼠分為6組,每組10只動(dòng)物。依據(jù)實(shí)驗(yàn)⑴結(jié)果分析,實(shí)驗(yàn)組按照給予LPS后不同時(shí)間點(diǎn)分為2h、4h、6h組,對(duì)照組按實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)設(shè)立對(duì)照,給予股靜脈泵入生理鹽水3ml/kg,泵速同前。二、動(dòng)物標(biāo)本采集和處理實(shí)驗(yàn)⑵:每組大鼠給予處理至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血(3-4ml),之后迅速剪開胸腔,剪取心臟置于4℃的生理鹽水中,以便于心臟內(nèi)的殘余血泵出,留取左心室肌,-80℃冰箱保存,用于Real-timePCR及Western Blot檢測(cè)。采集的動(dòng)脈血放置15min后離心,3000r/min離心10min,取上清裝入EP管,-80℃冰箱保存,用于ELISA檢測(cè)。三、大鼠心肌細(xì)胞急性分離選擇LPS 4h大鼠為實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組為相同時(shí)間點(diǎn)給予生理鹽水的大鼠,每組8只,給藥方式同前。采用Langendorff裝置進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌注,消化液恒壓灌流的方法分離單個(gè)心肌細(xì)胞。四、新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)選取生后1天的Wistar大鼠,無(wú)菌條件下取左心室肌,采用磁力攪拌器、胰酶和膠原酶混合多次消化的方法分離心肌細(xì)胞,并進(jìn)行原代培養(yǎng),給予LPS孵育后進(jìn)行鈣瞬變測(cè)量和分子生物學(xué)檢測(cè)。五、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)1.活體大鼠左心室插管術(shù)及心功能測(cè)定。2.ELISA方法檢測(cè)大鼠血清肌鈣蛋白I(cTn I)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)。3.Real-timePCR檢測(cè)心肌組織β1、2、3-AR及各亞型NOS mRNA表達(dá)。4.Western Blot檢測(cè)心肌組織β1、2、3-AR及各亞型NOS蛋白表達(dá)。5.單個(gè)心肌細(xì)胞收縮/舒張功能及鈣瞬變的測(cè)定。6.原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞多細(xì)胞鈣瞬變測(cè)定。7.Real-timePCR檢測(cè)心肌細(xì)胞β1、2、3-AR及NOS2 mRNA表達(dá)。8.Western Blot檢測(cè)心肌細(xì)胞β3-AR及NOS2蛋白表達(dá)。9.不同藥物組多細(xì)胞鈣瞬變的自身對(duì)照研究。六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析一正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,兩組間比較用t檢驗(yàn),獨(dú)立樣本多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),連續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P﹤0.05為有顯著性差異。結(jié)果1.膿毒休克大鼠MAP及在體左心功能變化大鼠給予靜脈泵入LPS后約1.5h開始出現(xiàn)血壓下降,至泵入后2h血壓可較基礎(chǔ)值下降25—30%,達(dá)到休克模型。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MAP變化,模型組的變化與對(duì)照組相比整體趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05),模型組2h、4h、6h的MAP值較其0h的基礎(chǔ)值相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),而對(duì)照組MAP隨時(shí)間變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明此方法制作的膿毒性休克模型給藥后2h成模,且模型穩(wěn)定。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)收縮期左室內(nèi)壓上升的最大速率(+dp/dtmax)變化,模型組的變化與對(duì)照組相比整體趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05),模型組2h、4h、6h值較其0h的基礎(chǔ)值相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),而對(duì)照組+dp/dtmax隨時(shí)間變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。舒張期左室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dtmax)模型組的變化與對(duì)照組相比整體趨勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P﹤0.05),模型組4h、6h值較其0h的基礎(chǔ)值相比,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),而對(duì)照組-dp/dtmax隨時(shí)間變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.膿毒休克大鼠血清cTnI及CK-MB變化動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)膿毒性休克大鼠血清cTnI及CK-MB變化,各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。說(shuō)明此種方法誘導(dǎo)的膿毒性休克大鼠在6h內(nèi)未有明確心肌組織壞死或損傷。3.膿毒休克大鼠心肌組織β1、2、3-AR蛋白及mRNA表達(dá)膿毒性休克大鼠心肌組織β3-AR的蛋白水平在休克早期(模型2h)是升高的趨勢(shì),較同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),之后呈下降趨勢(shì),至休克晚期(模型6h)較對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05)。心肌組織β3-AR mRNA水平與蛋白水平變化一致。β1、2-AR的蛋白水平和mRNA水平與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.膿毒休克大鼠心肌組織各型NOS蛋白及mRNA表達(dá)膿毒性休克大鼠心肌組織NOS2蛋白水平在休克早期與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在LPS處理后4h、6h出現(xiàn)升高趨勢(shì),且與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),而心肌組織NOS2 mRNA水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組(P﹤0.05)。NOS1及NOS3蛋白水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NOS1 mRNA水平在LPS處理2h時(shí)較對(duì)照組明顯升高(P﹤0.01),NOS3mRNA水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組(P﹤0.05),但此兩種亞型的NOS與蛋白水平變化不一致,說(shuō)明在此模型中此兩種亞型可能不起到主要作用。5.膿毒休克大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞收縮/舒張功能經(jīng)LPS處理4h的大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞較對(duì)照組相比,在收縮幅度(peak shorting,PS)、收縮/舒張最大速率積分(+d L/dt、-dL/dt)方面明顯下降(P﹤0.01);在達(dá)到峰值90%的時(shí)程(time to 90%PS,TPS_(90))及舒張到90%的時(shí)程(time to 90%relengthening,TR_(90))方面明顯延長(zhǎng)(P﹤0.01)。6.膿毒休克大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞鈣瞬變經(jīng)LPS處理4h的大鼠單個(gè)心肌細(xì)胞較對(duì)照組相比,在靜息鈣濃度(baseline FFI)、收縮時(shí)鈣濃度峰值(peak FFI)及鈣瞬變幅度(deta FFI)方面明細(xì)下降(P﹤0.05);在鈣濃度恢復(fù)至基線水平90%的時(shí)間(TR_(90))及鈣衰減時(shí)間常數(shù)(tau)方面明顯延長(zhǎng)(P﹤0.01)。7.LPS誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞鈣瞬變?cè)囵B(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)終濃度為1μg/ml的LPS作用8、16、24h,24h組細(xì)胞較給予LPS前自發(fā)搏動(dòng)明顯減少,細(xì)胞狀態(tài)差,故未參與鈣瞬變的測(cè)定。與正常對(duì)照組比較,LPS16h組鈣瞬變發(fā)生了明顯變化,表現(xiàn)為鈣瞬變幅度(detaF/F0)降低、鈣濃度恢復(fù)50%的時(shí)程(TR_(50))延長(zhǎng)及鈣濃度衰減時(shí)間常數(shù)(tau)增加(P﹤0.05),而LPS 8h組變化較正常組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8.LPS誘導(dǎo)16小時(shí)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞β3-AR蛋白及β1、2、3-AR mRNA變化原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS孵育16小時(shí)后β3-AR蛋白及mRNA水平均較空白對(duì)照組升高(P﹤0.05),而β1、2-AR mRNA水平均較空白對(duì)照組變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。9.LPS誘導(dǎo)16小時(shí)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞NOS2蛋白及mRNA變化原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS孵育16小時(shí)后NOS2蛋白及mRNA水平均較空白對(duì)照組升高(P﹤0.05)。10.不同藥物組多細(xì)胞鈣瞬變的自身對(duì)照結(jié)果原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞經(jīng)LPS孵育16h后,在給予β1、2-AR特異性抑制劑同時(shí)激動(dòng)β3-AR整體鈣瞬變下降,與normal組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹤0.05),提前給予NOS抑制劑后此作用消失。結(jié)論1.LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克大鼠模型穩(wěn)定,心功能隨時(shí)間點(diǎn)延長(zhǎng)而呈持續(xù)下降趨勢(shì),未出現(xiàn)明顯心肌損傷。β3-AR在整個(gè)膿毒性休克過(guò)程中可能起到保護(hù)作用。NOS2在整個(gè)膿毒性休克過(guò)程中相對(duì)其他兩種亞型發(fā)揮了主要作用,其與β3-AR的關(guān)系需進(jìn)一步研究。2.膿毒休克大鼠心肌細(xì)胞在除外神經(jīng)體液因素的基礎(chǔ)上仍然存在心肌收縮/舒張功能障礙及鈣穩(wěn)態(tài)失衡。3.原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞在終濃度為1μg/ml的LPS誘導(dǎo)16h后出現(xiàn)整體鈣瞬變的降低,激動(dòng)β3-AR后細(xì)胞自身的鈣瞬變隨時(shí)間延長(zhǎng)下降,且通過(guò)NOS途徑發(fā)揮此作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

成簇生長(zhǎng)×100圖 3.1，心肌細(xì)胞圖片3.心肌細(xì)胞的鑒定⑴倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)⑵心肌細(xì)胞 α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗甲醛固定室溫 30min，PBS 洗 3 次，5minPBS 洗滌 3 次，5min/次；5%BSA 封閉度（1：200）的抗體(小鼠抗大鼠 α-Sar靜置 10min，PBS 洗 3 次，5min/次；加入抗體），避光室溫染色 4h，用 PBS 洗 3工作濃度 0.5-10ug/ml），每孔 150ul，室溫甘油封閉后照相、計(jì)數(shù)（圖 2），經(jīng)統(tǒng)計(jì)

心肌細(xì)胞鑒定圖（×400）細(xì)胞經(jīng)鈣熒光指示劑負(fù)載后，倒置熒光顯微鏡下可看到心刺激后可看到心肌細(xì)胞跟隨電刺激頻率的一致性跳動(dòng)。.3，經(jīng)鈣熒光指示劑負(fù)載后的心肌細(xì)胞靜態(tài)圖（×10）立及標(biāo)本收集

323，經(jīng)鈣熒光指示劑負(fù)載后的心肌細(xì)胞靜態(tài)圖（×10）立及標(biāo)本收集養(yǎng)心肌細(xì)胞鈣瞬變測(cè)定模型：取 6 孔板爬片培養(yǎng)的 72 小常對(duì)照組；LPS 組細(xì)胞給予 LPS 終濃度為 1μg/ml（文獻(xiàn)濃16、24 小時(shí)，正常對(duì)照組給予空白培養(yǎng)基 2ml 孵育相同養(yǎng)心肌細(xì)胞標(biāo)本收集：取 LPS 作用 16 小時(shí)及相應(yīng)時(shí)間瓶生長(zhǎng)，5ml 培養(yǎng)基），采用酶消化法收集細(xì)胞標(biāo)本。具，PBS 洗一遍，加入 1ml 含胰酶 0.25%的 PBS，放入培養(yǎng)見(jiàn)原來(lái)貼壁細(xì)胞懸浮于液體中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使大部分培養(yǎng)基中和，輕柔吹打，收集液體至離心管中，1000r，胞沉淀放入含 10%DMSO 培養(yǎng)基中，凍存管-80℃
【參考文獻(xiàn)】

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