本研究一共探討了四種檢測核酸的新技術,其中包含兩種滾環(huán)擴增檢測方法和兩種PCR檢測方法。結合滾環(huán)擴增和近紅外熒光等技術,開發(fā)了兩種滾環(huán)擴增檢測技術。將CRISPR基因編輯應用到PCR技術中,從而發(fā)展了兩種CRISPR輔助PCR檢測技術。1.NM-NIRF-spRCA核酸檢測技術通過靜電吸附和紫外交聯(lián),帶正電荷的尼龍膜(Nylon membrane,NM)可以簡單方便地固定核酸分子。因此,它是一種常用于核酸檢測的固相載體。滾環(huán)擴增(Rolling circle amplification,RCA)是廣泛用于核酸檢測的等溫DNA擴增技術。近紅外熒光(Near infrared fluorescence,NIRF)是一種新的熒光技術,具有背景低、信噪比高、靈敏度高等優(yōu)點。本章將NM、RCA和NIRF等材料及技術相結合,開發(fā)了一種在尼龍膜上檢測核酸的簡單方法,命名為基于近紅外熒光的尼龍膜固相滾環(huán)擴增技術(NM-NIRF-spRCA)。該方法只需要兩種核酸分子:滾環(huán)(RC)和3′末端帶有RCA引物的靶特異性探針(-PP)。檢測程序由四個步驟組成:(ⅰ)通過紫外交聯(lián)將靶核酸固定在NM上;(ⅱ)RC和NM上固定的靶核酸與特異性探針雜交;(ⅲ)進行含有Biotin-dUTP的RCA擴增;(ⅳ)用NIRF標記的鏈霉親和素溫育NM并用NIRF成像儀成像。通過檢測寡核苷酸、質(zhì)粒中的各種HPV亞型的L1片段和大腸桿菌基因組DNA,充分驗證了該方法。因此該研究為檢測核酸分子提供了一種新的簡便方法。2.SLP-RCA核酸檢測技術本章介紹了一種使用莖環(huán)引物(Stem-loop primer,SLP)進行滾環(huán)擴增的新技術。該技術能夠在固相和液相中通過線性或超分支滾環(huán)擴增(SLP-1RCA或SLP-HRCA)檢測靶DNA。對于固相檢測,SLP-HRCA分四步檢測核酸:(ⅰ)將各種捕獲探針(Capture probe,CP)共價結合在固相載體上形成CP陣列;(ⅱ)將CP陣列與DNA樣品雜交;(ⅲ)用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反應液在CP陣列上進行RCA反應;(ⅳ)將CP陣列成像。在液相中,SLP-HRCA檢測核酸只需一步:進行包含DNA樣品、SLP1和SLP2的實時RCA反應。液相和固相檢測都采用通用的滾環(huán)模板、SLP2和特異于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通過檢測寡核苷酸和六種不同的人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),初步驗證了該技術。還在宮頸癌細胞(HeLa和SiHa)和臨床樣品中檢測到了兩種高危型HPV(HPV16和HPV18),這充分驗證了該技術的可行性。本研究為RCA核酸檢測提供了新的途徑。3.Cas9/sgRNA輔助反向PCR核酸檢測技術本章開發(fā)了一種基于Cas9核酸酶檢測靶DNA的新方法,該方法被命名為CARP(Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR)即Cas9/sgRNA輔助反向PCR。該技術可以簡單、快捷、特異和靈敏地檢測靶DNA。該技術分三步來檢測靶DNA:(ⅰ)Cas9與一對特異的sgRNA結合后切割靶DNA;(ⅱ)用DNA連接酶連接切割產(chǎn)物;(ⅲ)用PCR擴增靶DNA。在連接步驟中,Cas9切割的靶DNA可以在分子內(nèi)連接成環(huán)狀或在分子間連接成線形DNA。最后用一對反向引物通過PCR擴增連接產(chǎn)物。通過在9種不同人乳頭狀瘤病毒(HPV)亞型中檢測HPV16和HPV18 L1基因驗證了該技術。該技術還在兩個HPV陽性宮頸癌細胞(HeLa和SiHa)的基因組DNA中檢測到了兩個高危型HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV陰性宮頸癌細胞C-33a中沒有檢測到這兩個基因。通過這些概念驗證,本研究提供了一種新的基于CRISPR的DNA檢測和分型的方法。特別是本研究驗證的CARP方法已進行了HPV臨床檢測,成功地檢測了一批臨床樣品。4.CRISPR分型PCR核酸檢測技術本章發(fā)展了一種利用CRISPR技術檢測目標DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR(CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR)。該技術檢測目標DNA只需一步反應:用熒光定量PCR(qPCR)擴增檢測Cas9/sgRNA切割后的DNA樣品。直接在qPCR反應程序之前額外加一段恒溫孵育時間,使Cas9/sgRNA切割反應合并到qPCR反應中。這樣就可以用僅僅2個小時的時間來均相檢測目標DNA。在整個檢測過程中無需打開檢測管,ctPCR的全部檢測過程可以通過常用的核酸檢測設備(熒光定量PCR儀)在較短的時間內(nèi)完成。通過檢測十種不同的人乳頭瘤病毒(HPV)亞型的L1基因驗證了該技術。該技術在兩種HPV陽性宮頸癌細胞(HeLa和SiHa)中成功地檢測了兩種高危HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV陰性的宮頸癌細胞中沒有檢測到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通過檢測臨床樣品中的HPV進一步驗證了ctPCR方法。因此,本研究提供了一種基于CRISPR的檢測和分型DNA的新方法。
【學位單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

東南大學博士學位論文產(chǎn)物上雜交一段寡核苷酸形成雙鏈，然后用限制性內(nèi)切酶消化，隨后通過模板介導的酶連反應生成許多新的環(huán)形 DNA�？梢允褂眠@些新環(huán)作為模板，用第二組引物進行下一步擴增[20]。Komiyama 和他的同事用切克酶將線性 RCA 產(chǎn)物切割成多種引物進行下一步擴增[21]。

圖 1-2 IRDye 800CW 的激發(fā)波長和吸收波長。400–800 nm 波段，水（藍線）、肌紅蛋白（綠線）和氧合肌紅蛋白（紅線）的熒光光譜，以及 Li-Cor Biosciences 公司兩種近紅外熒光染料（IRDye680 與 IRDye 800CW）的最大發(fā)射波長。（圖片改編自 http://www.licor.com/）本實驗室有一臺 Odyssey 近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)（LI-COR，美國），該系統(tǒng)在傳統(tǒng)紅外激光器的基礎上，開發(fā)了雙色熒光雙通道檢測技術，增強了熒光信號的檢出能力。這項技術充分發(fā)揮了近紅外熒光的巨大優(yōu)勢，在檢測中消除了可見光光譜內(nèi)的自發(fā)熒光。所以該系統(tǒng)背景熒光低、信噪比高。在微孔板[96, 109]、玻璃基片[29]和尼龍膜[109]等固相載體上檢測核酸分子時，使用近紅外熒光技術能夠有效地降低背景從而極大地提高檢測靈敏度。我們實驗室已經(jīng)將近紅外熒光成像系統(tǒng)用于檢測蛋白質(zhì)、甲基化、微生物和轉錄因子表達調(diào)控等[96, 109-112]，在此基礎上，我們結合滾環(huán)擴增技術發(fā)展了更為簡單靈敏的核酸檢測方法。1.3 PCR 擴增技術1985 年，Kary Mullis 發(fā)明了一種以 DNA 片段為模板，可以得到數(shù)百萬份拷貝的方法，即聚合酶鏈式反應（PCR）。該過程改革了許多生物科學和醫(yī)學的 DNA 檢測方式。他在 1993

東南大學博士學位論文指（Zinc finger，ZF）核酸酶轉錄因子[125, 126]，來自黃單胞菌的 TALE（Transcription activator-likeeffectors）[127-130]，以及最近來自 II 型細菌適應性免疫系統(tǒng) CRISPR（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats）的 RNA 引導的 DNA 內(nèi)切核酸酶 Cas9[131, 132]。
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本文編號：2849973