本研究一共探討了四種檢測(cè)核酸的新技術(shù),其中包含兩種滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法和兩種PCR檢測(cè)方法。結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增和近紅外熒光等技術(shù),開(kāi)發(fā)了兩種滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)。將CRISPR基因編輯應(yīng)用到PCR技術(shù)中,從而發(fā)展了兩種CRISPR輔助PCR檢測(cè)技術(shù)。1.NM-NIRF-spRCA核酸檢測(cè)技術(shù)通過(guò)靜電吸附和紫外交聯(lián),帶正電荷的尼龍膜(Nylon membrane,NM)可以簡(jiǎn)單方便地固定核酸分子。因此,它是一種常用于核酸檢測(cè)的固相載體。滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification,RCA)是廣泛用于核酸檢測(cè)的等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)。近紅外熒光(Near infrared fluorescence,NIRF)是一種新的熒光技術(shù),具有背景低、信噪比高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本章將NM、RCA和NIRF等材料及技術(shù)相結(jié)合,開(kāi)發(fā)了一種在尼龍膜上檢測(cè)核酸的簡(jiǎn)單方法,命名為基于近紅外熒光的尼龍膜固相滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(NM-NIRF-spRCA)。該方法只需要兩種核酸分子:滾環(huán)(RC)和3′末端帶有RCA引物的靶特異性探針(-PP)。檢測(cè)程序由四個(gè)步驟組成:(ⅰ)通過(guò)紫外交聯(lián)將靶核酸固定在NM上;(ⅱ)RC和NM上固定的靶核酸與特異性探針雜交;(ⅲ)進(jìn)行含有Biotin-dUTP的RCA擴(kuò)增;(ⅳ)用NIRF標(biāo)記的鏈霉親和素溫育NM并用NIRF成像儀成像。通過(guò)檢測(cè)寡核苷酸、質(zhì)粒中的各種HPV亞型的L1片段和大腸桿菌基因組DNA,充分驗(yàn)證了該方法。因此該研究為檢測(cè)核酸分子提供了一種新的簡(jiǎn)便方法。2.SLP-RCA核酸檢測(cè)技術(shù)本章介紹了一種使用莖環(huán)引物(Stem-loop primer,SLP)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的新技術(shù)。該技術(shù)能夠在固相和液相中通過(guò)線性或超分支滾環(huán)擴(kuò)增(SLP-1RCA或SLP-HRCA)檢測(cè)靶DNA。對(duì)于固相檢測(cè),SLP-HRCA分四步檢測(cè)核酸:(ⅰ)將各種捕獲探針(Capture probe,CP)共價(jià)結(jié)合在固相載體上形成CP陣列;(ⅱ)將CP陣列與DNA樣品雜交;(ⅲ)用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反應(yīng)液在CP陣列上進(jìn)行RCA反應(yīng);(ⅳ)將CP陣列成像。在液相中,SLP-HRCA檢測(cè)核酸只需一步:進(jìn)行包含DNA樣品、SLP1和SLP2的實(shí)時(shí)RCA反應(yīng)。液相和固相檢測(cè)都采用通用的滾環(huán)模板、SLP2和特異于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通過(guò)檢測(cè)寡核苷酸和六種不同的人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),初步驗(yàn)證了該技術(shù)。還在宮頸癌細(xì)胞(HeLa和SiHa)和臨床樣品中檢測(cè)到了兩種高危型HPV(HPV16和HPV18),這充分驗(yàn)證了該技術(shù)的可行性。本研究為RCA核酸檢測(cè)提供了新的途徑。3.Cas9/sgRNA輔助反向PCR核酸檢測(cè)技術(shù)本章開(kāi)發(fā)了一種基于Cas9核酸酶檢測(cè)靶DNA的新方法,該方法被命名為CARP(Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR)即Cas9/sgRNA輔助反向PCR。該技術(shù)可以簡(jiǎn)單、快捷、特異和靈敏地檢測(cè)靶DNA。該技術(shù)分三步來(lái)檢測(cè)靶DNA:(ⅰ)Cas9與一對(duì)特異的sgRNA結(jié)合后切割靶DNA;(ⅱ)用DNA連接酶連接切割產(chǎn)物;(ⅲ)用PCR擴(kuò)增靶DNA。在連接步驟中,Cas9切割的靶DNA可以在分子內(nèi)連接成環(huán)狀或在分子間連接成線形DNA。最后用一對(duì)反向引物通過(guò)PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物。通過(guò)在9種不同人乳頭狀瘤病毒(HPV)亞型中檢測(cè)HPV16和HPV18 L1基因驗(yàn)證了該技術(shù)。該技術(shù)還在兩個(gè)HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞(HeLa和SiHa)的基因組DNA中檢測(cè)到了兩個(gè)高危型HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV陰性宮頸癌細(xì)胞C-33a中沒(méi)有檢測(cè)到這兩個(gè)基因。通過(guò)這些概念驗(yàn)證,本研究提供了一種新的基于CRISPR的DNA檢測(cè)和分型的方法。特別是本研究驗(yàn)證的CARP方法已進(jìn)行了HPV臨床檢測(cè),成功地檢測(cè)了一批臨床樣品。4.CRISPR分型PCR核酸檢測(cè)技術(shù)本章發(fā)展了一種利用CRISPR技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR(CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR)。該技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)DNA只需一步反應(yīng):用熒光定量PCR(qPCR)擴(kuò)增檢測(cè)Cas9/sgRNA切割后的DNA樣品。直接在qPCR反應(yīng)程序之前額外加一段恒溫孵育時(shí)間,使Cas9/sgRNA切割反應(yīng)合并到qPCR反應(yīng)中。這樣就可以用僅僅2個(gè)小時(shí)的時(shí)間來(lái)均相檢測(cè)目標(biāo)DNA。在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需打開(kāi)檢測(cè)管,ctPCR的全部檢測(cè)過(guò)程可以通過(guò)常用的核酸檢測(cè)設(shè)備(熒光定量PCR儀)在較短的時(shí)間內(nèi)完成。通過(guò)檢測(cè)十種不同的人乳頭瘤病毒(HPV)亞型的L1基因驗(yàn)證了該技術(shù)。該技術(shù)在兩種HPV陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞(HeLa和SiHa)中成功地檢測(cè)了兩種高危HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞中沒(méi)有檢測(cè)到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通過(guò)檢測(cè)臨床樣品中的HPV進(jìn)一步驗(yàn)證了ctPCR方法。因此,本研究提供了一種基于CRISPR的檢測(cè)和分型DNA的新方法。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R440
【部分圖文】：

東南大學(xué)博士學(xué)位論文產(chǎn)物上雜交一段寡核苷酸形成雙鏈，然后用限制性內(nèi)切酶消化，隨后通過(guò)模板介導(dǎo)的酶連反應(yīng)生成許多新的環(huán)形 DNA�？梢允褂眠@些新環(huán)作為模板，用第二組引物進(jìn)行下一步擴(kuò)增[20]。Komiyama 和他的同事用切克酶將線性 RCA 產(chǎn)物切割成多種引物進(jìn)行下一步擴(kuò)增[21]。

圖 1-2 IRDye 800CW 的激發(fā)波長(zhǎng)和吸收波長(zhǎng)。400–800 nm 波段，水（藍(lán)線）、肌紅蛋白（綠線）和氧合肌紅蛋白（紅線）的熒光光譜，以及 Li-Cor Biosciences 公司兩種近紅外熒光染料（IRDye680 與 IRDye 800CW）的最大發(fā)射波長(zhǎng)。（圖片改編自 http://www.licor.com/）本實(shí)驗(yàn)室有一臺(tái) Odyssey 近紅外雙色熒光成像系統(tǒng)（LI-COR，美國(guó)），該系統(tǒng)在傳統(tǒng)紅外激光器的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了雙色熒光雙通道檢測(cè)技術(shù)，增強(qiáng)了熒光信號(hào)的檢出能力。這項(xiàng)技術(shù)充分發(fā)揮了近紅外熒光的巨大優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)中消除了可見(jiàn)光光譜內(nèi)的自發(fā)熒光。所以該系統(tǒng)背景熒光低、信噪比高。在微孔板[96, 109]、玻璃基片[29]和尼龍膜[109]等固相載體上檢測(cè)核酸分子時(shí)，使用近紅外熒光技術(shù)能夠有效地降低背景從而極大地提高檢測(cè)靈敏度。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)將近紅外熒光成像系統(tǒng)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)、甲基化、微生物和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)調(diào)控等[96, 109-112]，在此基礎(chǔ)上，我們結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展了更為簡(jiǎn)單靈敏的核酸檢測(cè)方法。1.3 PCR 擴(kuò)增技術(shù)1985 年，Kary Mullis 發(fā)明了一種以 DNA 片段為模板，可以得到數(shù)百萬(wàn)份拷貝的方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。該過(guò)程改革了許多生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)的 DNA 檢測(cè)方式。他在 1993

東南大學(xué)博士學(xué)位論文指（Zinc finger，ZF）核酸酶轉(zhuǎn)錄因子[125, 126]，來(lái)自黃單胞菌的 TALE（Transcription activator-likeeffectors）[127-130]，以及最近來(lái)自 II 型細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng) CRISPR（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats）的 RNA 引導(dǎo)的 DNA 內(nèi)切核酸酶 Cas9[131, 132]。
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6 ;關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知[J];中國(guó)輸血雜志;2015年03期

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8 鄧曄;;血站核酸檢測(cè)的質(zhì)量控制分析[J];人人健康;2016年22期

9 閆玉剛;楊立輝;丁靜;陜姍;王琦;;核酸檢測(cè)與酶免檢測(cè)在寧夏地區(qū)無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代養(yǎng)生;2017年08期

10 ;關(guān)于做好血站核酸檢測(cè)工作的通知[J];中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公報(bào);2015年02期

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本文編號(hào)：2849973