發(fā)布時(shí)間：2020-10-18 17:14

　　 背景:生物分子包含生物體內(nèi)的蛋白、核酸、糖類等大、小分子物質(zhì),作為生物體內(nèi)主要的活性成分,其在促進(jìn)新陳代謝、維持供能、促進(jìn)生長發(fā)育、傳遞遺傳信息、產(chǎn)生免疫等方面起著重要作用。其中蛋白、核酸類生物標(biāo)志物的有無或豐度高低對(duì)于疾病的預(yù)防、早期診斷、治療監(jiān)控具有重要意義。目前,常規(guī)的生物分子檢測技術(shù)有免疫學(xué)檢測技術(shù)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。兩類方法雖然在臨床上得以廣泛應(yīng)用,但因其耗時(shí)、操作復(fù)雜,依賴特殊的儀器設(shè)備,不適用于臨床快速、便攜、POCT的需求,極大的限制了生物分子在臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。因此,尋找一種快速、準(zhǔn)確、便攜、高靈敏、成本低廉的生物分子檢測平臺(tái),對(duì)生物分子用于臨床早期診斷、治療以及生理狀態(tài)監(jiān)測具有重要意義。目的:以價(jià)格便宜、形狀可控的紙基材料為基底,構(gòu)建超敏的生物分子檢測識(shí)別技術(shù),實(shí)現(xiàn)蛋白類分子快速鑒定。通過對(duì)痕量核酸類分子準(zhǔn)確定量,為生物分子檢測提供一種全新的思路和方法。從根本上降低檢測成本,簡便操作過程,縮短響應(yīng)時(shí)間,提高檢測靈密度,實(shí)現(xiàn)儀器設(shè)備小型化、便攜化,為復(fù)雜環(huán)境或貧困地區(qū)生物分子檢測創(chuàng)造條件。方法與結(jié)果:本研究開發(fā)了基于紙基芯片檢測生物分子的關(guān)鍵技術(shù),實(shí)現(xiàn)了對(duì)蛋白和核酸的快速、高效檢測。第一部分:基于染料顯色的血型鑒定紙基芯片技術(shù)構(gòu)建1.通過不同紙基材料孔徑大小、結(jié)構(gòu)排列的篩選,以及對(duì)全血層析情況對(duì)比,選用玻璃纖維膜作為層析墊和加樣墊,棉漿紙作為抗體墊和反應(yīng)墊進(jìn)行血型紙基芯片的構(gòu)建;進(jìn)一步篩選出GF2型分離膜用于全血血漿分離,通過分離的血漿與相應(yīng)試劑紅細(xì)胞是否發(fā)生凝集,并結(jié)合溴甲酚綠(BCG)與血漿/全血反應(yīng)顏色的不同判讀血型結(jié)果。進(jìn)一步為提高血型鑒定紙基芯片檢測的效率,我們對(duì)紅細(xì)胞抗原和抗體濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明20%的試劑紅細(xì)胞為最佳反定型抗原濃度,包被在紙基芯片上的抗A、抗B最適稀釋濃度為1/32,抗D最適稀釋濃度為1/64。2.以BCG與人血清白蛋白(HAS)特異性結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)綠色變化,BCG與全血反應(yīng)產(chǎn)生褐色變化的特性,并結(jié)合檢測特征光譜輔助判讀結(jié)果,從而建立了以BCG作為顯色劑的血型鑒定技術(shù),同時(shí)該技術(shù)不受類血液顏色物質(zhì)的干擾,極大提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。3.成功實(shí)現(xiàn)2min內(nèi)無需離心的ABO正反定型同步血型檢測,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了30s內(nèi)ABO正定型和ABD血型檢測,本研究以紙基材料為基礎(chǔ)建立的快速、便攜血型鑒定芯片,為血型鑒定在極端條件下的應(yīng)用提供了可能。第二部分:基于紙基石墨烯陣列芯片的核酸檢測平臺(tái)構(gòu)建1.選用均勻、表面較為光滑的碳紙為基底,采用等離子體增強(qiáng)化學(xué)氣相沉積(PECVD)的方式垂直生長石墨烯陣列,最后通過電化學(xué)沉積AuNPs,構(gòu)建出紙基石墨烯陣列芯片電極。其極大的增加了電極有效的比表面積,從而提升了探針在電極上包被的容量;此外,紙基芯片電極上的石墨烯陣列呈現(xiàn)為排列緊湊、分布均一的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并垂直豎立在碳紙表面,增加了靶標(biāo)miRNA與石墨烯陣列上固定的探針之間來回碰撞的頻率,從而提高有效雜交的機(jī)會(huì),保證檢測的靈敏度。2.利用雙鏈特異性核酸酶(DSN)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,在靶標(biāo)miRNA存在的條件下,電活性物質(zhì)修飾的DNA探針和靶標(biāo)miRNA形成雙鏈DNA-miRNA復(fù)合物,DSN酶切降解DNA-miRNA復(fù)合體中的DNA,釋放靶標(biāo)miRNA,并重新與剩余的DNA探針雜交,開始新一輪酶切、釋放和雜交過程,使大量DNA探針上的電活性物質(zhì)脫離電極表面,導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)改變,實(shí)現(xiàn)將痕量miRNA檢測轉(zhuǎn)化成特征性的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)輸出。同時(shí),利用DSN酶對(duì)核酸序列單堿基差異區(qū)分的能力,確保了紙基石墨烯陣列芯電極片對(duì)miRNA檢測良好的特異性。3.所構(gòu)建的紙基石墨烯陣列芯片傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA-155和miRNA-21并行同步檢測,具有良好的線性響應(yīng)。其線性范圍為:100 aM-10 nM,線性方程分別為:Y=4.98logC+89.11和Y=5.69 logC+103.34,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論:本研究中,基于紙基材料構(gòu)建的生物分子檢測芯片傳感器,具有準(zhǔn)確性高,響應(yīng)速度快,便于攜帶,檢測成本低的特點(diǎn),且其制作方法簡單、成本低廉,易于大批量生產(chǎn)和大范圍推廣應(yīng)用,在復(fù)雜環(huán)境下,特別是偏遠(yuǎn)地區(qū)或者貧困地區(qū)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和意義。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R440
【文章目錄】：
縮略語表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 基于染料顯色的血型鑒定紙基芯片技術(shù)構(gòu)建
    2.1 材料與方法
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 基于紙基石墨烯陣列芯片的核酸檢測平臺(tái)構(gòu)建
    3.1 材料與方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 紙基生物傳感器在臨床診斷領(lǐng)域的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果
致謝

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