一、研究背景由于燃料廢氣的排放,吸煙及工作環(huán)境等原因,各種有害致癌物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重改變正常肺組織生存的微環(huán)境,導(dǎo)致炎癥疾病外,甚至引起肺部腫瘤的發(fā)生。據(jù)統(tǒng)計(jì),2013年中國(guó)的癌癥患者中,肺癌患者人數(shù)在男性中處于首位,在女性患者中僅次于乳腺癌。此外,因癌癥而死亡的患者中,肺癌患者占到了第一位。肺癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療及靶向治療有四種方式。然而,每一種治療手段都是一把雙刃劍,既有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),也有不可忽視的缺點(diǎn)。其中,放療在肺癌的早期及晚期治療中有著重要的作用,但是放療在通過(guò)射線殺死腫瘤的同時(shí),不可避免的對(duì)放射野內(nèi)正常肺組織產(chǎn)生不必要的損傷,導(dǎo)致放射性肺炎的產(chǎn)生,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后情況。其次,由于部分腫瘤細(xì)胞本身對(duì)輻射的抵抗性,增加臨床放療劑量的同時(shí),又會(huì)加重對(duì)正常肺組織的損傷。目前,針對(duì)臨床放射性肺炎的治療主要是通過(guò)給予糖皮質(zhì)激素緩解病人癥狀,而長(zhǎng)時(shí)間使用激素會(huì)對(duì)人體帶來(lái)嚴(yán)重的副作用。因此,我們研究的目的是為了找出一種在放療中既能保護(hù)正常肺組織又能增強(qiáng)腫瘤治療的藥物。原花青素是目前已知的抗氧化能力最強(qiáng)的天然提取物,遠(yuǎn)高于日常使用的維生素C及維生素E。其具有來(lái)源廣泛,提取成本低,毒性低及水溶性好的優(yōu)勢(shì)。此外,原花青素的生物體內(nèi)的半數(shù)致死劑量超過(guò)5000mg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于治療劑量。原花青素對(duì)肺組織相關(guān)炎癥及疾病具有較好的治療作用:原花青素可以有效減輕角夾膠誘導(dǎo)的肺組織急性炎癥反應(yīng),減輕小鼠哮喘模型的急性氣道炎癥反應(yīng),抑制肺水腫的形成,且對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺炎具有很好的治療作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果發(fā)現(xiàn),原花青素可以顯著減輕輻照后早期放射性肺炎的炎癥滲出和晚期放射性肺纖維化的發(fā)生,降低輻射所導(dǎo)致的肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度,減輕炎癥因子TGF-β1、ET-1、IFN-γ、IL-4和IL-13的改變程度。另外,與其他抗氧化劑不同的是,原花青素是一種緩釋抗氧化劑,他可以在血液和組織中存留7-10天,發(fā)揮持續(xù)的抗氧化作用,這對(duì)于病情進(jìn)行性進(jìn)展的放射性肺損傷的防治具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。此外,原花青素還具有抗腫瘤作用。過(guò)去的十年體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已經(jīng)證明原花青素對(duì)皮膚癌,乳腺癌,前列腺癌,頭頸部腫瘤和肺癌等腫瘤細(xì)胞增殖具有明確抑制作用。研究者還在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)原花青素對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力沒(méi)有明顯影響,而只對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出殺傷作用。綜合以上的特點(diǎn),我們推測(cè),原花青素有希望在肺癌放療過(guò)程中,防護(hù)放射野內(nèi)正常的肺組織的同時(shí),對(duì)肺癌細(xì)胞又起到抑制增殖的作用。本課題將重點(diǎn)研究原花青素在肺癌放療中的雙向作用及其分子機(jī)制。二、研究?jī)?nèi)容(一)小鼠原位肺癌荷瘤模型的建立。通過(guò)原位肺內(nèi)注射法建立原位肺癌模型。特點(diǎn):以左肺上葉作為肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境,通過(guò)基質(zhì)膠固定細(xì)胞位置。(二)原花青素在肺癌放療中的雙向作用。1、原花青素在細(xì)胞作用中的研究。(1)通過(guò)CCK8檢測(cè)原花青素在小鼠正常肺上皮細(xì)胞MLE-12及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中的毒性;(2)通過(guò)流式檢測(cè)及克隆形成率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)原花青素對(duì)肺正常細(xì)胞的輻射防護(hù)作用及對(duì)肺腫瘤細(xì)胞的輻射增敏作用。2、原花青素在肺癌模型中的作用。(1)原花青素能夠抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移(1)原花青素抑制小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng);(2)原花青素抑制小鼠腫瘤的轉(zhuǎn)移。(2)原花青素影響荷瘤小鼠局照后的生存狀況;(3)原花青素對(duì)荷瘤小鼠局照后腫瘤大小及肺葉重量的影響;(4)原花青素減少荷瘤小鼠局照后正常肺組織的炎性滲出;(5)原花青素能夠減少小鼠肺正常組織照射后的凋亡,而促進(jìn)照射后腫瘤組織的凋亡,同時(shí)抑制其增值;(6)原花青素能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-6及IFN-γ的分泌。(三)原花青素在肺癌放療中雙向作用的機(jī)制研究。1、原花青素可以明顯降低輻照后A549及BEAS-2B細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生;2、原花青素對(duì)肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)的p-ERK、p-JNK及p-P38表達(dá)情況的影響具有差異;3、原花青素可以激活肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞Sirt6蛋白的表達(dá);4、研究肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)Sirt6蛋白后p-ERK、p-JNK及p-P38的表達(dá)情況;5、通過(guò)抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá),觀察Sirt6的表達(dá)情況,判斷Sirt6蛋白在原花青素中的作用。三、研究方法(一)建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型。1、用胰島素注射器將腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)膠的混懸液注射入小鼠左上肺葉,建立小鼠肺部原位肺癌荷瘤模型;2、使用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的固定小鼠模具,采取鉛塊遮擋的方式建立肺部局照放射模型;3、照射方式:采用25Gy~(60)Coγ射線單次照射,劑量率為1Gy/min。(二)研究原花青素在肺癌放療中的雙向作用1、選取小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12、肺癌細(xì)胞LLC及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行試驗(yàn);(1)細(xì)胞分組:對(duì)照組、原花青素處理組、照射組、照射組加原花青素處理組,每種細(xì)胞分組相同,照射劑量為8Gy;(2)細(xì)胞照射及原花青素處理后對(duì)正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響:流式細(xì)胞儀檢測(cè)及克隆形成率;2、在小鼠原位肺癌荷瘤模型的基礎(chǔ)上檢測(cè)原花青素的雙向作用(1)小鼠分為:假手術(shù)對(duì)照組、假手術(shù)肺部照射組、肺部荷瘤對(duì)照組、肺部荷瘤原花青素處理組、肺部荷瘤照射組及肺部荷瘤原花青素加照射組,共6組,每組選用雄性8周C57BL/6小鼠3只;(2)原花青素及照射對(duì)原位荷瘤小鼠的生存影響:檢測(cè)荷瘤小鼠生存期及體重;(3)原花青素及照射對(duì)原位荷瘤小鼠腫瘤的影響:檢測(cè)腫瘤大小,HE染色及小鼠左上肺葉重量;(4)免疫熒光檢測(cè)正常肺組織及腫瘤組織的增殖和凋亡:Ki67和p53染色;(5)檢測(cè)原花青素對(duì)小鼠免疫細(xì)胞因子的影響:用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清細(xì)胞因子IL-6和IFN-γ。(三)原花青素在肺癌放療中雙向作用的分子機(jī)制1、檢測(cè)原花青素對(duì)照射后細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除:ROS檢測(cè)試劑盒;2、檢測(cè)原花青素對(duì)照射后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白變化的影響:Western blot;3、檢測(cè)原花青素對(duì)照射后原位荷瘤小鼠正常肺組織及腫瘤組織蛋白的影響:Western blot;4、通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)Sirt6的表達(dá)檢測(cè)p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá):Sirt6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、Western blot;5、通過(guò)選取抑制劑S1805、SP600125及SB203580分別抑制p-ERK、p-JNK及p-P38蛋白的表達(dá),觀察Sirt6的表達(dá)情況:Western blot。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)成功建立小鼠原位肺癌荷瘤模型及肺部局部放射模型1、成功建立小鼠左上肺葉原位肺癌荷瘤模型,腫瘤生長(zhǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求;2、成功建立荷瘤小鼠肺部局部照射模型。(二)原花青素在肺正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞放療中的雙向作用1、對(duì)小鼠肺正常及腫瘤細(xì)胞的雙向研究:通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè),發(fā)現(xiàn)原花青素能夠減少小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12照射后的凋亡;通過(guò)克隆形成率實(shí)驗(yàn),原花青素對(duì)小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12具有輻射防護(hù)作用,對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞LLC具有輻射增敏作用;2、對(duì)人肺正常及腫瘤細(xì)胞的雙向研究:通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè),發(fā)現(xiàn)原花青素能夠減少人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡且促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞A549的凋亡;通過(guò)克隆形成率實(shí)驗(yàn),原花青素對(duì)人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞具有輻射防護(hù)作用,且能夠抑制人肺腺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng),具有輻射增敏作用;(三)原花青素在原位肺癌荷瘤小鼠放療中的雙向作用研究1、通過(guò)觀察并記錄原位肺癌荷瘤小鼠的生存情況,發(fā)現(xiàn):原花青素處理加照射組相比于照射組,其存活時(shí)間更長(zhǎng);2、通過(guò)對(duì)小鼠肺內(nèi)腫瘤的測(cè)量,發(fā)現(xiàn):原花青素處理加照射抑制小鼠左上肺葉內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng),相比較于單純照射組,效果更加明顯;3、通過(guò)熒光免疫分別標(biāo)記增殖相關(guān)蛋白Ki67及凋亡相關(guān)蛋白p53,發(fā)現(xiàn):在小鼠正常肺組織內(nèi),原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達(dá)量明顯降低;在腫瘤組織內(nèi),單純處理組的Ki67的表達(dá)量相比于對(duì)照組明顯降低,而原花青素加照射組與單純照射組相比,p53表達(dá)量明顯升高;4、通過(guò)ELISA檢測(cè)荷瘤小鼠血清細(xì)胞因子的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn):原花青素加照射組相比于單純照射組,能夠明顯抑制IL-6、提高IFN-γ的表達(dá),促進(jìn)對(duì)腫瘤的抑制,降低炎性損傷。(四)原花青素在肺癌放療中的可能作用機(jī)制1、原花青素能夠顯著清除人肺癌細(xì)胞A549及正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B照射后所產(chǎn)生的自由基;2、在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素明顯提高照射后p-JNK蛋白的表達(dá);在人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中,原花青素可以明顯抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,而這與其能夠清除活性氧自由基有關(guān)。3、在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素通過(guò)增加Sirt6蛋白的表達(dá)進(jìn)而改變p-JNK、p-P38蛋白的變化,促進(jìn)輻射增敏作用五、結(jié)論在細(xì)胞層面上我們發(fā)現(xiàn),原花青素對(duì)小鼠肺癌細(xì)胞LLC及人肺癌細(xì)胞A549具有輻射增敏作用,對(duì)小鼠肺正常細(xì)胞MLE-12及人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B具有輻射防護(hù)作用。在人肺癌細(xì)胞A549中,原花青素可以通過(guò)提高Sirt6蛋白的表達(dá)進(jìn)而改變p-JNK、p-P38蛋白的變化,促進(jìn)輻射增敏作用。在人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B中,原花青素可能通過(guò)清除活性氧自由基,抑制p-JNK、p-ERK及p-P38的增高,降低炎癥作用。通過(guò)建立小鼠原位肺癌的放療模型,我們發(fā)現(xiàn)原花青素能提高小鼠的生存期,可以改變血清細(xì)胞因子的表達(dá),能夠減少小鼠肺正常組織的輻射損傷,同時(shí)對(duì)腫瘤具有放療增敏的作用。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R734.2;R730.55
【部分圖文】：

小鼠荷瘤部位

荷瘤用胰島素注射器

以正常進(jìn)食進(jìn)水。分別于荷瘤后第 7、10、14、21 及 30 天處死小鼠，取荷葉觀察大體（圖 1.3）�？捎^察到：小鼠左肺上葉所荷腫瘤隨著時(shí)間逐漸增大0 天左右，荷瘤小鼠大部分死亡，解剖胸腔可見(jiàn)大量腫瘤胸腔轉(zhuǎn)移。以荷瘤肺最大橫截面積位置做石蠟切片并 H&E 染色（圖 1.3）。其中，深染部為腫瘤為正常腫瘤組織。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2842439