基因治療在臨床應用中遇到了相對嚴重的瓶頸,即缺乏安全有效的基因傳遞系統(tǒng)。為了解決這一問題,我們設計了一種低毒高效的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng),用于轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,以期提高目的基因的遞送效率,從而促進內(nèi)皮細胞的增殖與遷移。1.八氨基籠型倍半硅氧烷POSS-NH_3~+Cl~-在堿性條件下與2-溴異丁基酰溴反應,得到大分子引發(fā)劑POSS-(Br)_8,然后通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)依次引發(fā)甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)和聚乙二醇單甲基丙烯酸酯(PEGMA)的聚合,以制備具有生物相容性的POSS核心的八臂星型梳狀結(jié)構(gòu)的共聚物POSS-PDMAEMA-PPEGMA。梳狀PPEGMA的側(cè)鏈末端被雙鍵化以便于CAGW或CAG-TAT-NLS功能肽的連接,從而合成具有多功能性的星型共聚物。肽功能化的星型共聚物在水中自組裝成納米粒(NPs),并用綠色熒光蛋白融合質(zhì)粒pEGFP-ZNF580(pDNA)制備NPs/pDNA復合物。經(jīng)MTT證實,形成的復合物毒性較低。熒光顯微鏡和流式細胞儀測試結(jié)果顯示,這些多靶向功能化的基因復合物能有效轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞,其轉(zhuǎn)染效率高于陽性對照PEI 25 kDa。此外,western blot印跡實驗、傷口愈合實驗和體外血管形成實驗也證明復合物可以有效地在內(nèi)皮細胞中遞送和表達pDNA,轉(zhuǎn)染后的細胞具有較高遷移率并且提升了內(nèi)皮化能力。這些具有梳狀結(jié)構(gòu)和POSS核心的星型共聚物是一種具有潛力的基因治療載體。2.星型梳狀聚合物POSS-PDMAEMA-PPEGMA(POSS-DP)與質(zhì)粒pDNA復合形成二元基因復合物POSS-DP/pDNA,然后多重靶向性的功能肽TAT-NLS或CAG-TAT-NLS與二元基因復合物混合,以形成三元基因遞送系統(tǒng)POSS-DP/pDNA/TAT-NLS與POSS-DP/pDNA/CAG-TAT-NLS。相比較于傳統(tǒng)的二元基因遞送系統(tǒng),設計的三元基因遞送系統(tǒng)具有相對更高的靈活性,便于負載與釋放基因。通過細胞攝取實驗和體外熒光轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果證明設計的遞送系統(tǒng)有利于細胞攝取以及提升內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染效率。
【學位單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R450;O631
【部分圖文】：

圖 1-1 基因治療的臨床實驗所涉及到疾病類型及其分布Figure 1-1 Clinical trials of gene therapy involve disease types and their distribution自那時以來，科學家們嘗試從基因水平上探索疾病的治療方法，并且基因治療的臨床試驗逐漸在全球范圍獲得批準。根據(jù) Wiley 數(shù)據(jù)庫的最新統(tǒng)計情況，截

圖 1-2 細胞內(nèi)基因傳遞過程。（A）與細胞膜的多重相互作用導致通過巨胞飲作用、吞噬作用和受體介導的內(nèi)吞作用（小窩和網(wǎng)格蛋白）使復合物內(nèi)化。（B）早期內(nèi)涵體的形成（i）；被捕獲在內(nèi)涵體中的復合物在后期內(nèi)涵體或溶酶體中被消化（ii）并通過胞吐作用從細胞中除去（iii）。（C）（i）通過質(zhì)子海綿效應誘導復合物從內(nèi)涵體逃逸，進入細胞質(zhì)，其中聚合物被細胞質(zhì)或細胞內(nèi)的酶逐漸降解（ii）。（D）復合物也可以通過核定位信號肽（NLS）直

我們采用了1H NMR 測試。首先是使用 DMSO-d6作為溶劑，測試了原料八氨基 POSS-NH3+Cl-的結(jié)構(gòu)，如下圖2-2 所示。在 0.71 ppm、1.72 ppm 和 2.76 ppm 處可以分別觀察到 POSS-NH3+Cl-的特征峰 Si-CH2-CH2-CH2-N（a，b，c，6H），而且三處峰的峰面積接近于 1：1：1。同時可以看到 POSS 的末端氨基（-NH3+，3H）的氫質(zhì)子在 8.15 ppm 處出現(xiàn)一個強峰。圖 2-2 八氨基 POSS 在 DMSO-d6溶劑中的氫核磁圖Figure 2-21H NMR of the POSS-NH3+Cl-in DMSO-d6在堿性條件下用 BIBB 溶液酰胺化八氨基 POSS 以合成八臂引發(fā)劑POSS-(Br)8，并且其1H NMR 譜圖如下圖 2-3 所示。 POSS 鏈的特征峰Si-CH2-CH2-CH2-N（a，b
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本文編號：2836422