研究背景膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙,是急危重癥病人最常見的死因之一。多臟器功能衰竭是其主要并發(fā)癥,其中心肌損傷所致心功能障礙最為常見,發(fā)病率高達(dá)50%。膿毒癥時(shí)參與固有免疫反應(yīng)的炎性細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)和NK細(xì)胞及適應(yīng)性免疫細(xì)胞T/B淋巴細(xì)胞發(fā)生激活、凋亡或自噬,從而破壞了機(jī)體正常的免疫應(yīng)答,從而加重膿毒癥患者的病情。同時(shí),隨著病情發(fā)展,往往伴有過度的交感神經(jīng)系統(tǒng)激活、兒茶酚胺大量釋放、心率加快,加重了心臟負(fù)荷和氧耗,限制心室舒張時(shí)間,導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈灌注不足,加重心肌損傷,在后面心功能障礙的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究目的本文旨在通過研究膿毒癥時(shí)DC成熟和激活與心肌損傷之間的關(guān)系、與交感神經(jīng)系統(tǒng)過度興奮之間關(guān)系,探討DC在膿毒癥心肌損傷發(fā)生發(fā)展中的作用,為臨床治療尋找新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。研究方法1.脂多糖(LPS)對(duì)骨髓源樹突狀細(xì)胞的影響研究選用5只6-8周齡SPF級(jí)C57BL6雄性小鼠,取小鼠單個(gè)股骨骨髓細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析鑒定,純化后的DC分為兩組,一組加25μg/LLPS共培養(yǎng),另一組不加LPS為對(duì)照組,培養(yǎng)24h,收集細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)(qPCR)檢測(cè)IL-6、IL-12和TNF-α表達(dá)水平,Western Blot 測(cè)定 IL-6、TNF-α表達(dá)水平。2.樹突狀細(xì)胞在膿毒癥心肌損傷中的作用研究選用80只8-12周齡SPF級(jí)C57BL6雄性小鼠,隨機(jī)分為四組即:WT-LPS-sham、WT-LPS-VAG539、WT-sham、WT-VAG539 組。WT-LPS-VAG539組和WT-VAG539組給予DC抑制劑(VAG539;30 mg/kg主要抑制DC CD86和CD11c表達(dá)),對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃,每天2次共2天,隨后WT-LPS-sham 組和 WT-LPS-VAG539 組給予 LPS 腹腔注射(10mg/kg),WT-sham組和WT-VAG539組給予生理鹽水腹腔注射(10mg/kg),造模時(shí)間6h。造模給藥后統(tǒng)一飲食及環(huán)境溫度喂養(yǎng),每24小時(shí)統(tǒng)計(jì)每組死亡小鼠數(shù)量至14天。采用無創(chuàng)小動(dòng)物尾動(dòng)脈套管法測(cè)量小鼠尾動(dòng)脈血壓。采用超聲心動(dòng)圖儀檢測(cè)心率(HR)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF%)和短軸縮短率(FS%)。流式細(xì)胞儀分析造模后24小時(shí)小鼠心臟組織中DC的成熟標(biāo)志物CD86和CD11c。ELISA法檢測(cè)心臟組織中免疫炎癥因子TNF-α、IL-12、IL-6表達(dá)水平。免疫組化檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Bax和Bc1-2。3.交感神經(jīng)興奮與樹突狀細(xì)胞活化相互作用在膿毒癥心肌損傷中的作用研究選用40只7-8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠,隨機(jī)分為四組,即WT-sham、WT-LPS-sham、WT-LPS-Ate、WT-LPS-VAG539 組。WT-LPS-VAG539 組給予DC抑制劑(VAG539;30mg/kg主要抑制DCCD86和CD11c表達(dá))、對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃,每天2次共2天,隨后脂多糖(LPS)腹腔注射(10mg/kg),造模時(shí)間24h,成模后WT-LPS-Ate組給予阿替洛爾(5mg/kg),空白組給予生理鹽水腹腔注射(10mg/kg)。采用powerlab系統(tǒng)記錄交感神經(jīng)放電和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo),高效液相色譜測(cè)定血漿中去甲腎上腺素(NE)含量,免疫組化法檢測(cè)心肌中TNF-α樹突狀細(xì)胞的含量。研究結(jié)果1.LPS對(duì)骨髓源樹突狀細(xì)胞的影響研究骨髓來源的DCs用LPS(25μg/ml 處理24小時(shí)后,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DC成熟標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)LPS可明顯上調(diào)CD40,CD80和CD86表達(dá)的水平,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05),雖然可升高M(jìn)HCII的表達(dá),但無顯著性差異。qPCR和Western blotting檢測(cè)DC表達(dá)的炎性細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-12和TNF-α表達(dá)水平升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05)。2.樹突狀細(xì)胞在膿毒癥心肌損傷中的作用研究給予LPS腹腔注射后24小時(shí)至14天中,WT-LPS-sham組48h死亡率高達(dá)50%,96h死亡率為80%,14d為85%;WT-LPS-VAG539組小鼠48h死亡率為15%,96h為35%,14天為45%,與WT-LPS-sham組相比死亡率顯著降低(P0.05)血流動(dòng)力學(xué)方面,WT-LPS-VAG539與WT-VAG539組相比,WT-LPS-sham與WT-sham相比,HR均加快,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05),WT-LPS-VAG539組HR為704±25次/分,WT-LPS-sham組HR為798±28次/分,VAG539處理組心率顯著降低(?)P0.05)。WT-LPS-VAG539與WT-VAG539組相比,WT-LPS-shame與WT-sham相比,MBP均下降,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05),WT-LPS-VAG539組MBP為68±6mmhg,WT-LPS-shamMBP為42±2mmhg,VAG539處理組MBP升高并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((?)P0.05)。通過超聲心動(dòng)圖觀察小鼠心功能,發(fā)現(xiàn)與WT-sham組相比,LPS誘導(dǎo)組,EF%和FS%明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05);與WT-LPS-sham組相比,WT-LPS-VAG539組有所改善,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P0.05)。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)心臟中mDC數(shù)目,發(fā)現(xiàn)LPS處理前后心肌組織中DC數(shù)量增加,WT組由1.8%增至6.5%,WT+VAG539組由1.6%增至3.7%。ELISA法檢測(cè)心臟組織中的TNF-α、IL-12、IL-6水平,結(jié)果顯示LPS處理可誘導(dǎo)心臟組織炎癥因子表達(dá),與WT-sham組相比,LPS誘導(dǎo)組,TNF-α、IL-12、IL-6水平均升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05);與WT-LPS-sham組相比,WT-VAG539-LPS 組 TNF-α、IL-12、IL-6 表達(dá)下調(diào),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(#P0.05)。免疫組化法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況顯示,經(jīng)LPS誘導(dǎo)的WT-LPS-sham組和WT-LPS-VAG539組與WT-sham組相比,Bax水平升高,Bcl-2水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);WT-LPS-VAG539 與 WT-LPS-sham 比較,Bax 升高 Bcl-2降低的不平衡態(tài)有所改善,且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。表明LPS誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡,而通過抑制DC細(xì)胞,能在一定程度上改善細(xì)胞凋亡。3.交感神經(jīng)興奮與樹突狀細(xì)胞活化相互作用在膿毒癥心肌損傷中的作用研究與WT-sham組相比,經(jīng)LPS誘導(dǎo)24h的三組大鼠左室舒張末壓(LVEDP)增大(P0.05),左室壓力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)降低(P0.05),心率加快(P0.05)。早期給予阿替洛爾后或DC抑制劑后,上述癥狀有所改善,與WT-LPS-sham組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。高效液相色譜實(shí)驗(yàn)顯示,與WT-sham組相比,經(jīng)LPS誘導(dǎo)24h的三組大鼠血漿中NE水平升高(P0.05)。給予β受體阻滯劑阿替洛爾后,NE水平降低,與WT-LPS-sham組比較,具有顯著性差異(P0.05)。WT-LPS-VAG539組與WT-LPS-sham相比,NE水平也顯著降低(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示,經(jīng)LPS誘導(dǎo)的模型組大鼠心肌TNF-α水平較WT-sham升高(P0.05)。給予DC抑制可明顯降低TNF-α浸潤(P0.05)。WT-LPS-Ate組心肌細(xì)胞TNF-α浸潤水平有所降低(P0.05)。WT-LPS-Ate組大鼠心肌細(xì)胞CD含量較WT-sham組明顯升高(P0.05)。WT-LPS-VAG539組與WT-LPS-sham組相比顯著降低(P0.05),WT-LPS-Ate組與WT-LPS-sham組相比,也存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低(P0.05)。交感神經(jīng)放電研究顯示,與WT-sham組比較,經(jīng)LPS誘導(dǎo)的大鼠腎交感神經(jīng)放電活動(dòng)明顯增加(P0.05),給予Ate或DC抑制劑后與WT-LPS-sham組相比有所降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)結(jié)論在LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥中,LPS可促進(jìn)DC在心臟組織中成熟和聚集,通過激活多種免疫細(xì)胞來增加炎癥因子表達(dá),導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷、功能障礙及凋亡。同時(shí)交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活促進(jìn)了 DC介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),DC細(xì)胞的激活也促進(jìn)交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮,二者相互作用加劇膿毒癥時(shí)心肌損傷。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R459.7
【部分圖文】：

料學(xué)假設(shè)

邐北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士研宄生學(xué)位論文邐逡逑實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．邐ＬＰＳ處理可誘導(dǎo)ＤＣ成熟。逡逑骨髓來源的ＤＣｓ用ＬＰＳ邋（２５邋ｐｇ／ｍｌ）處理２４小時(shí)后，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)逡逑ＤＣ成熟標(biāo)志物。發(fā)現(xiàn)ＬＰＳ可明顯上調(diào)ＣＤ４０，邋ＣＤ８０和ＣＤ８６表達(dá)的水平（＊尸＜逡逑０．０５），雖然可升高ＭＨＣＩＩ的表達(dá)，但無顯著性差異，提示ＬＰＳ可促進(jìn)ＤＣ成逡逑熟。逡逑ＣＤ４０邐ＣＤ８０邐ＣＤ８６邐ＭＨＣ邋ＩＩ逡逑

°邐？邐２３％邐°邐２８％邐°邐＾邐４２．６％邐°邐１邐＾８．２％逡逑＾邐＃邐會(huì)＃邐＾邐、邐ｆ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐會(huì)邐會(huì)邐會(huì)邐會(huì)逡逑會(huì)？邐１邐備邐會(huì)ｎ丨逡逑１０２邋１０３邐１０４邋１０ｆ邐１０２邐１０３邐１０４邋１０５邐１０２邋１０３邐１０４邋１０５邐１０２邋１０３邋１０４邋１０５逡逑0逡逑＾—逡逑Ｑ邐？邐７６％邐°邐１邐８０．４％邐°邐９１．４％邐°邐９１．６％逡逑２邐＾邐ｍ邐－邋ｇ邐－邐ｔ邐＾邐ｔ逡逑ａ邐ｊ＂邐會(huì)邋Ｌ邋＾邐＇邐會(huì)逡逑１０２邋１０２邐１０４邋１０５邐１０２邐１０３邐１０４邋１０５邐１０２邋１０３邐１０４邋１０５邐１０２邋１０３邋１０４邋１０５逡逑邐？邋ＦＩＴＣ逡逑圖１．邋ＬＰＳ處理可誘導(dǎo)ＤＣ成熟標(biāo)志物的表達(dá)。逡逑２．邐ＬＰＳ處理可誘導(dǎo)ＤＣ活化。逡逑骨髓來源的ＤＣｓ用ＬＰＳ邋（２５噸／ｍｌ）處理２４小時(shí)后，用ｑＰＣＲ技術(shù)檢測(cè)ＤＣ逡逑表達(dá)的炎癥因子。發(fā)現(xiàn)ＬＰＳ可明顯上調(diào)ＩＬ－６、ＩＬ－１２和ＴＮＦ－ａ表達(dá)的水平提示逡逑ＬＰＳ邋可誘導(dǎo)邋ＤＣ邋激活。＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ＶＳ．邋ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ；邋＊＊Ｐ＜０．０１邋ＶＳ．邋ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ。逡逑

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3 郝崢崢;血漿四連接素水平在膿毒癥診斷的潛在價(jià)值初探[D];河南大學(xué);2018年

4 羅玉龍;瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠心臟、肝臟、腎臟的保護(hù)作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2017年

5 王凱;青藤堿對(duì)膿毒癥大鼠TH1/TH2、內(nèi)皮功能及肺損傷的影響[D];南華大學(xué);2018年

6 陳小花;鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜下膿毒癥機(jī)械通氣患者血清CD4+/CD8+的變化[D];南華大學(xué);2018年

7 張娟;右美托咪定對(duì)膿毒癥相關(guān)性腦病患者的影響[D];南華大學(xué);2018年

8 王潔;探索膿毒癥外周血TLR-4基因表達(dá)量與炎癥因子表達(dá)之間的相關(guān)性[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

9 王瑜慧;抗血小板藥物對(duì)膿毒癥肝損傷的影響作用[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

10 隋偉男;老年與青壯年膿毒癥患者凝血功能改變的比較[D];中國醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2827836