第一部分:靶向激活Nrf2信號通路在a GVHD中的作用研究目的:研究激活Nrf2信號通路在a GVHD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:建立小鼠同基因造血干細胞移植(sys-HSCT)和異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)后小鼠a GVHD模型,在移植后7天獲取小鼠靶器官脾臟、肝臟、肺臟和小腸組織,抽提RNA,采用熒光定量PCR法檢測各靶器官中的Nrf2的表達水平,比較同基因/異基因HSCT對Nrf2的影響。采用C57BL/6(H-2b)小鼠脾臟淋巴細胞作為效應(yīng)細胞,采用輻照的BALB/c(H-2d)小鼠骨髓來源DCs作為刺激細胞,體外建立混合淋巴細胞反應(yīng)體系,通過加入不同濃度的Nrf2激動劑富馬酸二甲酯(DMF),采用~~3H-Td R摻入法、CFSE標記法和ANNEXINV/PI法,檢測T細胞的增殖、凋亡情況。ELISA檢測上清中細胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。研究DMF激活Nrf2后對異基因反應(yīng)性T細胞增殖、凋亡和活化的影響。體外采用anti-CD3/CD28刺激T細胞活化,然后加入不同濃度的DMF,采用~3H-Td R摻入法研究DMF對非特異性T細胞激活后的增殖情況。體外采用GM-CSF聯(lián)合IL-4法從小鼠骨髓中誘導(dǎo)DCs,然后加入不同濃度的DMF或LPS,流式檢測DCs表面CD80、CD86和CD40的表達水平,ELISA檢測上清中IL-6和IFN-γ和TNF-α的水平,研究DMF對DCs活化和成熟的影響。采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作為供體,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作為受體。受體小鼠接受清髓性預(yù)處理(全身照射8.5Gy),通過輸注1×10~7骨髓細胞+5×10~6脾臟細胞建立小鼠a GVHD模型。于預(yù)處理前3天予DMF灌胃(30mg/kg/d),連續(xù)給藥7天。移植后每天兩次觀察小鼠生存狀態(tài),每3天進行a GVHD臨床評估。4周后收集小鼠肝臟、肺、腸和皮膚行HE染色并進行病理組織學(xué)分析。研究體內(nèi)激活Nrf2后對小鼠a GVHD的影響。結(jié)果:(1)熒光定量PCR結(jié)果顯示,和syn-HSCT相比,allo-HSCT 7天后小鼠靶器官脾臟、肝臟、肺臟和小腸組織中的Nrf2的表達水平顯著降低,提示allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明顯下調(diào),該通路的減弱提示allo-HSCT小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激活性增高。(2)體外混合淋巴細胞反應(yīng)結(jié)果表明,DMF能夠以劑量依賴的方式抑制同種異基因反應(yīng)性T細胞的增殖,CFSE標記實驗表明CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖均受到明顯抑制;此外,細胞培養(yǎng)上清中的炎癥因子IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α也呈顯著降低,且呈劑量依賴性,表明DMF能夠抑制異基因反應(yīng)性T細胞的增殖和活化。細胞凋亡實驗表明,DMF能夠促進異基因反應(yīng)性CD4+T細胞和CD8+T細胞的凋亡;更重要的是,發(fā)生凋亡的細胞主要是CFSE~(low)的一群具有高增殖活性的細胞群體。(3)體外使用CD3/CD28刺激T細胞的實驗表明,DMF也能夠直接以劑量依賴的方式抑制T細胞的增殖。(4)DMF對DCs的成熟沒有明顯的促進作用,但是當(dāng)DCs預(yù)先被LPS活化后,DMF能夠以劑量依賴的方式抑制DCs表面CD80,CD86和CD40的表達,同時還能抑制IL-6和TNF-α等細胞因子的分泌,表明DMF對已經(jīng)成熟DCs的活化具有抑制作用。(5)動物實驗表明,在移植后早期應(yīng)該DMF干預(yù)能夠顯著延長a GVHD小鼠的生存,減輕a GVHD的癥狀,HE病理分析也表明DMF干預(yù)后組受鼠的a GVHD靶器官肝,肺,腸和皮膚的病理損害較對照組顯著減輕,表明DMF能夠改善小鼠的a GVHD癥狀,抑制a GVHD的發(fā)生發(fā)展。結(jié)論:allo-HSCT后小鼠Nrf2抗氧化通路明顯下調(diào),使用DMF激活Nrf2能夠抑制T細胞的增殖和細胞因子的分泌,抑制DCs的活化和IL-6和TNF-α的表達。體內(nèi)使用DMF干預(yù)可以顯著延長a GVHD小鼠的生存,減輕a GVHD的癥狀,抑制a GVHD的發(fā)生發(fā)展。第二部分:靶向激活Nrf2信號通路減弱a GVHD的機制研究目的:研究靶向激活Nrf2信號通路減弱小鼠a GVHD的免疫學(xué)機制。方法:分離allo-HSCT后14天的DMF干預(yù)組和對照組受體小鼠脾臟細胞,和經(jīng)照射的BALB/c小鼠脾細胞進行共同培養(yǎng),建立Ex-Vivo的混合淋巴細胞反應(yīng),通過~3H-Td R檢測細胞增殖情況。采用流式細胞術(shù)檢測移植后14d時DMF干預(yù)組和對照組小鼠脾臟中的CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞,活化的CD4(CD4+CD69+)、CD8細胞(CD8+CD69+)的比例,體外使用PMA/Ionomycin/BFA激活檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌細胞因子IFN-γ的情況,采用ELISA法檢測移植后14d兩組小鼠血清中IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。采用磁珠法分選小鼠脾臟中的CD3+T細胞,體外采用anti-CD3/CD28抗體激活T細胞,然后使用不同濃度的DMF處理,24h后檢測T細胞活化分子CD69、CD25、CD44以及PD-1的表達水平,研究DMF對T細胞體外活化的影響。采用活性氧Reactive Oxygen Species Assay Kit檢測試劑盒,檢測DMF處理后T細胞中ROS的表達水平,研究DMF對T細胞氧化水平的影響。抽提移植后14d兩組小鼠脾臟RNA,逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,采用熒光定量PCR法檢測抗氧化通路分子Nrf2,keap 1以及抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表達水平。采用免疫熒光法檢測DMF處理后T細胞內(nèi)Nrf2的入核情況。結(jié)果:(1)Ex-Vivo混合淋巴細胞實驗表明,DMF能夠顯著抑制體內(nèi)異基因反應(yīng)性T細胞的增殖。(2)流式細胞術(shù)檢測表明,移植后14d時,和對照組相比,DMF干預(yù)組小鼠脾臟中的CD3+T、CD4+T細胞的百分比顯著降低,而CD8+T細胞則明顯升高。DMF干預(yù)的受體小鼠的CD4+T和CD8+T細胞的活化明顯降低,其表面CD69的表達顯著減少,表明DMF可以減少a GVHD小鼠脾臟中的T細胞浸潤和活化,減輕a GVHD的異基因免疫應(yīng)答。(3)體外T細胞活化實驗表明,DMF能夠以劑量依賴的方式抑制T細胞活化,下調(diào)表面CD69,CD44以及PD-1的表達水平,但是卻輕微上調(diào)CD25的水平。(4)通過細胞內(nèi)染色檢測移植后14天的受體小鼠的CD4+和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平。結(jié)果顯示,DMF組受體小鼠脾臟CD4+T和CD8+T細分泌IFN-γ水平顯著降低,與此一致的是,血清中炎癥因子IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平在DMF組也顯著降低,表明DMF能夠抑制Th1細胞的免疫應(yīng)答,進而減輕a GVHD。(5)用活性氧檢測試劑盒檢測活化的T細胞中ROS水平,結(jié)果表明DMF可以以劑量依賴的方式抑制活化的T細胞中ROS水平;此外,通過q RT-PCR檢測受體鼠脾臟中Nrf2,keap1和抗氧化防御酶HO-1和GST-α1的m RNA表達。結(jié)果顯示,DMF組受體小鼠脾臟中Nrf2水平、HO-1和GST-α1的表達均顯著上調(diào),表明DMF能夠促進抗氧化反應(yīng),抑制小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激的水平。進一步通過免疫熒光實驗證實,DMF能夠促進T細胞內(nèi)Nrf2的入核,Nrf2入核是其發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的主要機制。結(jié)論:DMF能夠抑制供體T細胞同種異基因反應(yīng)性以及促炎癥細胞因子的分泌,上調(diào)抗氧化酶,減輕a GVHD。第三部分:靶向激活Nrf2信號通路促進Treg細胞分化發(fā)育目的:研究靶向激活Nrf2信號通路在Treg細胞分化發(fā)育中的作用,以及研究DMF減弱a GVHD是否是Treg細胞介導(dǎo)的。方法:采用流式細胞術(shù)檢測移植后14d時DMF干預(yù)組和對照組小鼠脾臟中的Treg細胞的水平,觀察DMF干預(yù)對小鼠Treg細胞的影響。通過磁珠分選小鼠CD4+T細胞,體外通過TGF-β和IL-2刺激建立Treg細胞誘導(dǎo)分化體系,通過給予不同濃度的DMF干預(yù)4d,研究DMF對Treg細胞體外分化的影響。采用BALB/c(H-2~d)小鼠作為受體。受體小鼠接受清髓性預(yù)處理(全身照射8.5Gy),通過輸注5×10~6去除T細胞的骨髓細胞+1×10~6純化的T細胞或者CD25-的T細胞,然后給予DMF干預(yù)處理,觀察體內(nèi)去除Treg細胞后,DMF對a GVHD的抑制作用是否仍然存在。ELISA檢測移植后14d時小鼠血清中TGF-β的水平。建立體外混合淋巴細胞反應(yīng),加入不同濃度的DMF,3d后檢測細胞培養(yǎng)上清中TGF-β的水平,研究DMF促進Treg分化的機制。結(jié)果:(1)流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)和對照組相比,DMF組小鼠脾臟中Treg細胞的比例及絕對值明顯增加,表明DMF在體內(nèi)可以增加Treg細胞的數(shù)目。(2)體外Treg誘導(dǎo)分化實驗表明DMF對Treg細胞的體外分化呈劑量依賴性促進作用。(3)為了進一步證實DMF對a GVHD的影響是通過促進Treg細胞來實現(xiàn),我們將供者T細胞中的Treg細胞剔除,然后建立a GVHD模型并給予DMF干預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)體內(nèi)清除Treg細胞后,DMF組保護a GVHD的作用被減弱了,小鼠的生存顯著低于DMF+不清除Treg細胞組。而在對照組中剔除Treg細胞,則不影響小鼠的a GVHD生存,表明DMF減弱a GVHD是通過Treg細胞介導(dǎo)的,剔除Treg細胞后DMF保護a GVHD的作用便減弱甚至消失了。(4)TGF-β是誘導(dǎo)Treg分化發(fā)育的最主要細胞因子,我們檢測了a GVHD小鼠體內(nèi)TGF-β和體外MLR體系中的TGF-β水平,結(jié)果表明DMF能夠促進小鼠脾臟TGF-β的水平,體外呈劑量依賴性的促進TGF-β的分泌,表明DMF誘導(dǎo)Treg細胞分化主要是通過誘導(dǎo)TGF-β的表達來實現(xiàn)的。結(jié)論:靶向激活Nrf2信號通路減弱a GVHD是Treg細胞依賴的,體內(nèi)剔除Treg細胞后DMF保護a GVHD的作用被明顯減弱,DMF能夠通過促進TGF-β的表達誘導(dǎo)Treg細胞的分化發(fā)育。第四部分:靶向激活Nrf2信號通路在GVL中的作用及機制研究目的:研究靶向激活Nrf2信號通路在allo-HSCT后移植物抗白血病(GVL)中的作用及機制。方法:采用C57BL/6(H-2~b)小鼠作為供體,采用BALB/c(H-2~d)小鼠作為受體。受體小鼠接受清髓性預(yù)處理(全身照射8.5Gy),通過輸注1×107骨髓細胞+5×10~6脾臟細胞+1×10~6個帶luciferase的A20細胞建立小鼠a GVHD/GVL模型。于預(yù)處理前3天予DMF灌胃(30mg/kg),連續(xù)給藥7天。移植后每天兩次觀察小鼠生存狀態(tài),每3天進行a GVHD臨床評估。移植后每周在小動物活體成像儀上實時觀測小鼠體內(nèi)的腫瘤負荷。將移植后兩周的小鼠的脾臟細胞作為效應(yīng)細胞,A20細胞作為靶細胞,采用Promega Cyto Tox96非放射性細胞毒檢測試劑盒檢測DMF作用后效應(yīng)細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。采用CCK-8法檢測DMF對A20細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果:(1)為了評估DMF對GVL效應(yīng)的影響,a GVHD小鼠在異基因造血干細胞移植后用A20-luc白血病細胞攻擊。結(jié)果表明只接受骨髓細胞加A20-luc白血病細胞移植的小鼠中,DMF組和對照組在移植后40天內(nèi)全部死亡,兩組生存沒有顯著差異,表明在沒有T細胞的情況下,DMF不能發(fā)揮GVL效應(yīng),DMF在體內(nèi)對腫瘤細胞的增殖沒有沒有抑制作用。但是當(dāng)接受異體骨髓和脾細胞的移植小鼠加上A20-luc后再給予DMF,則能夠顯著延長小鼠的生存,小動物活體成像表明DMF干預(yù)組的腫瘤負荷更低,提示GVL效應(yīng)得到保留,DMF能夠通過增強T細胞功能發(fā)揮GVL效應(yīng)。(2)體外細胞增殖實驗表明低濃度的DMF對A20細胞的增殖和沒有直接抑制作用,對細胞的凋亡也沒有明顯的促進作用。此外,細胞殺傷實驗顯示經(jīng)DMF干預(yù)的受者小鼠的供體T細胞顯示出更強的針對A20白血病細胞的CTL殺傷活性,表明DMF可以保持異基因造血干細胞移植后GVL效應(yīng)。結(jié)論:DMF在抑制a GVHD的同時能夠保留GVL效應(yīng),DMF對腫瘤細胞的增殖和凋亡沒有直接作用,但是能夠促進供體T細胞的細胞殺傷活性,從而發(fā)揮抗白血病效應(yīng)。
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R457.7
【部分圖文】：

Nrf2 信號通路在急性移植物抗宿主病中的作用及機制研究 引 言引 言異基因造血干細胞移植（allo-HSCT）已成為治療惡性血液系統(tǒng)腫瘤的最有效手段，allo-HSCT中供者來源的異基因反應(yīng)性T細胞在發(fā)揮抗白血病效應(yīng)（GVL）的同時，也會為受者帶來移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）的危險。因此如何有效平衡allo-HSCT后急性GVHD（acute GVHD，aGVHD）和GVL是提高移植療效的關(guān)鍵和難點所在[1]。目前aGVHD的治療主要依賴于皮質(zhì)類固醇及環(huán)孢素類免疫抑制劑，其功效有限卻有相當(dāng)大的毒性，部分患者仍然會發(fā)生嚴重的aGVHD，嚴重影響患者移植后生活質(zhì)量[1]。因此，尋找既能有效控制aGVHD發(fā)病率及嚴重程度，又能較好維持GVL效應(yīng)的治療方案是當(dāng)前異基因造血干細胞移植的熱點和難點問題。

言 Nrf2 信號通路在急性移植物抗宿主病中的作用及機膚等，通過 Fas/FasL、穿孔素、顆粒酶B以及釋放大量促炎細胞因子如IL-2、IFF-α，構(gòu)成細胞因子風(fēng)暴，攻擊受者靶細胞從而形成aGVHD病理損傷。移植前預(yù)處理損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量活性氧自由基（ROS），能導(dǎo)致氧化應(yīng)激反組織細胞凋亡和壞死，誘發(fā)組織炎癥，是靶器官損傷的重要因素（圖2）[3阻斷早期的免疫啟動階段，減輕預(yù)處理導(dǎo)致的組織損傷，降低炎性因子水平抑制aGVHD發(fā)生，減輕aGVHD進展的有效策略。

圖 3. ROS 來源及生理學(xué)作用。（Biochem J. 2011;435(3):545-51）核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2, Nrf2）是機體抗氧化的中樞調(diào)控因子[6]。Nrf2于1994年被鑒定為編碼轉(zhuǎn)錄激活劑的cDNA克隆，n-collar (CNC)家族，是攜帶有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子[7]。生理狀態(tài)下 胞 質(zhì) 中 與 Kelch 樣 環(huán) 氧 氯 丙 烷 相 關(guān) 蛋 白 （ Kelch-like ECH-assoin-1,Keap1）結(jié)合而被降解，不發(fā)揮生理作用。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)或

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉霜竹;馬守寶;劉海燕;吳德沛;;炎癥細胞因子在急性移植物抗宿主病中的作用及機制研究進展[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2017年01期

2 閆蓓;達萬明;;CD4~+CD25~+調(diào)節(jié)性T細胞及其與GVHD的關(guān)聯(lián)性[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2006年02期

本文編號：2825341