外泌體是大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)分泌的一種微小囊泡,其直徑在30～150 nm之間,攜帶著其來(lái)源細(xì)胞的功能核酸、蛋白質(zhì)等信息,最初它被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式,近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明外泌體是細(xì)胞間通訊交流的一種載體,與細(xì)胞的眾多生理學(xué)和病理學(xué)功能相關(guān),此外,外泌體還參與了腫瘤微環(huán)境的形成。因此,外泌體在疾病診斷、治療及預(yù)后過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。而目前還沒(méi)有形成規(guī)范的、統(tǒng)一的外泌體的分離和檢測(cè)技術(shù),現(xiàn)存的方法都或多或少存在不同的缺陷,因此,本文針對(duì)目前外泌體分離及檢測(cè)過(guò)程中存在的問(wèn)題,開(kāi)發(fā)了兩種外泌體檢測(cè)的新方法,一種通過(guò)雙重信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)血清樣本中外泌體的高靈敏度檢測(cè),另外一種方法創(chuàng)新性的將滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于外泌體的分離,實(shí)現(xiàn)了外泌體的分離、檢測(cè)以及蛋白分析一體化操作,為外泌體研究提供了一種新的思路。主要研究?jī)?nèi)容如下:1、利用雙重信號(hào)放大技術(shù)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2來(lái)源的外泌體進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。在這項(xiàng)工作中,我們利用適配體的靈活性設(shè)計(jì)了一種外泌體定量方法,將外泌體捕獲事件轉(zhuǎn)化為核酸檢測(cè)。利用發(fā)夾DNA級(jí)聯(lián)反應(yīng)(HDCR)和DNA樹(shù)突狀分子自組裝實(shí)現(xiàn)了雙重信號(hào)放大。CD63適配體和其封閉探針通過(guò)鏈霉親和素連接到磁珠上,作為捕獲元件。在目標(biāo)外泌體存在的情況下,適配體識(shí)別并與外泌體結(jié)合,釋放封閉探針作為啟動(dòng)HDCR(第一個(gè)信號(hào)放大過(guò)程)的引發(fā)鏈,打開(kāi)AuNP(AuNPs)表面固定的發(fā)夾DNA(HP1)。熒光標(biāo)記的DNA樹(shù)突狀大分子與HP1連接作為第二級(jí)信號(hào)放大,由此提高信噪比。在最優(yōu)條件下,我們的方法對(duì)HepG2細(xì)胞來(lái)源的外泌體取得了良好的線性響應(yīng),線性濃度范圍在1.75×1O3～7.0×106粒子/μL,檢測(cè)極限為1.16×103粒子/μL。另外,我們的方法對(duì)生物樣品中外泌體的檢測(cè)也顯示出良好的性能。2、構(gòu)建DNA-AuNP-Exo網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)低離心轉(zhuǎn)速的外泌體分離、檢測(cè)以及蛋白分析一體化。利用滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(RCA)產(chǎn)生包含多個(gè)功能域的長(zhǎng)鏈DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu),該長(zhǎng)鏈DNA由多個(gè)CD63適配體區(qū)、連接區(qū)、間隔區(qū)組成,由堿基互補(bǔ)配對(duì)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。當(dāng)CD63適配體與外泌體結(jié)合后,發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變,暴露出連接區(qū)(AuNP結(jié)合序列),通過(guò)toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng),AuNP上的探針與該長(zhǎng)鏈DNA的連接區(qū)結(jié)合,釋放熒光標(biāo)記的互補(bǔ)探針,產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào),同時(shí)形成DNA-AuNP-Exo網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),可通過(guò)低速離心實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體的分離。我們通過(guò)透射電鏡和共聚焦熒光顯微鏡證實(shí)了DNA-AuNP-Exo網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。此外,我們建立了熒光比率和外泌體濃度對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并通過(guò)LC/MS對(duì)分離的外泌體進(jìn)行了蛋白譜分析,質(zhì)譜得到的蛋白質(zhì)數(shù)量和超速離心法得到的蛋白質(zhì)數(shù)量非常接近。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.1
【部分圖文】：

囊泡（ＥＶｓ）有多種類型，從它們的大小和產(chǎn)生機(jī)制來(lái)說(shuō)主要包括三類：外泌體（直徑逡逑小于１５０ｎｍ）、微泡或脫落顆粒以及凋亡體，后兩者直徑都大于ｌＯＯｎｍ，并且直接由質(zhì)逡逑膜釋放。而外泌體的生成過(guò)程則不同｜１３１，如圖１．１所示首先由細(xì)胞膜向內(nèi)生芽形成逡逑早期內(nèi)體，然后早期內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)至多呿泡小體（ＭＶＢ），有的多囊泡小體和溶酶體融合后逡逑會(huì)將內(nèi)容物降解，有的多迤泡小體可以與質(zhì)膜融合釋放小囊泡（外泌體）到細(xì)胞外部。逡逑在外泌體生成的后期，ｉｌｌ邋ＲａｂＧＴＰａｓｅｓ２７Ａ和２７Ｂ介導(dǎo)多囊泡小體與質(zhì)膜融合Ｗ。逡逑Ｃ，Ｔ０Ｓ０１邋＇逡逑ＭＶＢ逡逑�。▕^）一⑩，Ｍ，＿逡逑＇ｖ邋邐邐邋＾邐、逡逑‘邐Ｍ邋？ｃ’ｏｙ？邐Ｉｍｍｕｎｏ邋ｒ？ｆｔ？ｌａｔｅ／逡逑……．？？參：ｅＳＱＱＦ＾逡逑ｃｅｌｌ邐響逡逑Ｌ＿邐１——二逡逑圖１．１外泌體的組成和分泌。逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑目前，可體外培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎都可以產(chǎn)生外泌體，外泌體的來(lái)源廣泛，在血液、唾逡逑液、尿液、羊水、腹水、乳汁等眾多體液以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中都能檢測(cè)到外泌體。外逡逑泌體的粒徑（３０？１５０邋ｎｍ）比較小，在電子顯微鏡視野下才能觀察到外泌體的杯狀結(jié)構(gòu)。逡逑由于外泌體是細(xì)胞分泌的囊泡

１．２．１超速離心法逡逑離心法是利用細(xì)胞、囊泡亞群和蛋白質(zhì)之間的大小差異進(jìn)行分離的。差速離心法是逡逑目前外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)，包括一系列逐步提速的離心步驟［５５］。圖１．２給出了超離心的逡逑工作流程示意圖［５６］，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在所有外泌體研宄中，超速離心法占５６％。使用標(biāo)準(zhǔn)離心逡逑法（＜２００００ｇ）可以分離大的組分包括細(xì)胞、凋亡小體和大的囊泡，而從蛋白混合物中逡逑分離外泌體則需要使用超速離心法ＯｌＯＯＯＯＯｇ）。超高的轉(zhuǎn)速、較長(zhǎng)的運(yùn)行時(shí)間（？５ｈ）逡逑以及需要嚴(yán)格的技術(shù)培訓(xùn)是其主要缺點(diǎn)［５７１。此外，超速離心法常常導(dǎo)致外泌體回收率（５％逡逑？２５％）較低ｔ％，并且經(jīng)常與蛋白聚集物一起沉淀下來(lái)。此外，這種方法也不適用于樣逡逑本量有限的病患，例如兒童患者。因此，其他的方法如蔗糖梯度離心法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)逡逑以提高外泌體的分離效率。逡逑

例如，Ｔａｎ課題組開(kāi)發(fā)了一種電化學(xué)檢測(cè)癌細(xì)胞外泌體的傳感器。他們引入了逡逑一種名為ＬＺＨ８的適配體，這種適配體可以特異性地識(shí)別ＨｅｐＧ２邋（肝癌細(xì)胞）及其外泌逡逑體１８２１。如圖１．３所示，適配體ＬＺＨ８與一個(gè)ＤＮＡ納米四面體相連。隨后，ＤＮＡ納米四逡逑面體被同定在金電極表面。固定化的適配體可以特異性地識(shí)別并捕獲ＨｅｐＧ２外泌體。逡逑在目標(biāo)外泌體存在的情況下，電極被外泌體覆蓋，電化學(xué)信號(hào)明顯下降。該電化學(xué)適配逡逑體傳感器可實(shí)現(xiàn)腫瘤外泌體的高靈敏度檢測(cè)。逡逑＾邐Ｅｘｏｓｏｍｅｓ逡逑ｍ邋／邐％逡逑Ｓ邐Ｅ邋Ａｐｔａｍｅｒ逡逑Ｒ邐ＡｆＫ邋ＤＮＡ逡逑ｙ邐ｉ邐ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ逡逑＇、逡逑４邋Ｓ邐８邋ｐ邐Ｓ逡逑（ｂ）Ｐ邐（Ｃ）邋１－＾．＾．ｒｏａ．逡逑？邋？邋？邐—－邋Ｍａ＊邋ｍｐｕｒｎｍｎ逡逑Ｉ邐ｔ邋！八土逡逑ＩＩＩ逡逑ｆｔ邐？＞邐Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋（Ｖ）逡逑圖１．３電化學(xué)檢測(cè)外泌體的Ｉ）ＮＡ納米四面體傳感器。逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ邋ｗｉｔｈ邋ｅｘｐａｎｄｅｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｕｓｉｎｇ邋ＤＮＡ邋ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒａ邋ｆｏｒ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑２０１７年，Ｓｔｕａｒｔ邋Ｉ）．邋Ｉｂｓｅｎ等人＿開(kāi)發(fā)了一種利用交流電動(dòng)（Ａ（’ｌ＿：）微阼列芯片裝界逡逑從血漿中快速分離和檢測(cè)外泌體的方法，如閣１．４所l:。ＡＣ１：芯片；Ｖ＂超過(guò)１０００個(gè)電逡逑極，屯極灰呢Q瞇畝囁姿懾危瑁恚柝蚰

本文編號(hào)：2819937