目的1.探究金諾芬(Auranofin,ARF)與抗腫瘤藥物伏立諾他(Vorinostat,SAHA)的藥物聯(lián)合在體外對(duì)革蘭陰性菌的抗菌活性的影響。2.探究多黏菌素B(Polymyxin B,PMNB)與SAHA新型藥物聯(lián)合對(duì)多耐藥革蘭陰性菌在體外以及體內(nèi)的抗菌活性的影響以及藥物聯(lián)合的抗菌作用機(jī)制。3.在金黃色葡萄球菌中誘導(dǎo)并篩選出金諾芬耐藥(Auranofin-resistant,AR)菌株,尋找目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)。材料與方法1.通過(guò)對(duì)五株革蘭陰性菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),棋盤微量稀釋法,來(lái)觀察ARF和SAHA聯(lián)合,其兩者抗菌活性是否產(chǎn)生協(xié)同作用。2.選取四株革蘭陰性菌株以及兩株多耐藥菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),棋盤微量稀釋法,來(lái)觀察PMNB和SAHA聯(lián)合后,其兩者抗菌活性是否產(chǎn)生協(xié)同作用。3.在體外通過(guò)時(shí)間-殺菌動(dòng)力試驗(yàn)分別分析ARF和SHAH、PMNB和SAHA兩種藥物聯(lián)合的抗菌活性。4.通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察,研究PMNB和SAHA藥物聯(lián)合對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。5.通過(guò)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行活性氧(Reactive oxygen species,ROS)分析以及添加ROS清除劑聯(lián)合通過(guò)時(shí)間殺菌動(dòng)力學(xué)研究,來(lái)探究PMNB與SAHA的聯(lián)合產(chǎn)生抗菌活性的作用機(jī)制。6.通過(guò)大蠟螟模型,來(lái)初步驗(yàn)證PMNB與SAHA藥物聯(lián)合,在體內(nèi)對(duì)革蘭陰性菌的抗菌作用。7.在高濃度金諾芬環(huán)境下,誘導(dǎo)對(duì)金諾芬耐藥的金黃色葡萄球菌RN450,通過(guò)分析藥敏試驗(yàn)的結(jié)果,來(lái)判斷最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)的改變情況。通過(guò)對(duì)耐藥菌株多次傳代后,觀察耐藥性是否穩(wěn)定。8.通過(guò)提取細(xì)菌基因組DNA,設(shè)計(jì)目的基因的引物,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase hain reaction,PCR)擴(kuò)增目的基因,得到的PCR產(chǎn)物純化,高通量測(cè)序,比對(duì)目標(biāo)基因的核苷酸序列,尋找并明確出導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生的突變位點(diǎn)。結(jié)果1.在ARF與SAHA聯(lián)合治療以及PMNB與SAHA聯(lián)合中,對(duì)大腸埃希菌,鮑曼不動(dòng)桿菌,肺炎克雷伯菌,銅綠假單胞菌均顯示出了良好的協(xié)同作用。2.對(duì)于ARF和SAHA、PMNB和SAHA兩組聯(lián)合,在體外的時(shí)間-殺菌動(dòng)力試驗(yàn)中與單一用藥相比,均明顯觀察到抗菌活性的增加。3.PMNB單獨(dú)治療組破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和完整性,而SAHA單一治療組對(duì)細(xì)胞形態(tài)并未發(fā)生改變。兩者聯(lián)合治療組后,反而對(duì)細(xì)胞膜的完整性有一定的保護(hù)作用。4.PMNB和SAHA的藥物聯(lián)合明顯增加了ROS的產(chǎn)生,加入ROS清除劑后,明顯抑制了藥物聯(lián)合的抗菌活性。5.在大蠟螟模型中,PMNB和SAHA的藥物聯(lián)合明顯增加了大蠟螟的生存率。6.篩選出五株金諾芬耐藥的金黃色葡萄球菌RN450的MIC明顯增加,并且在傳代培養(yǎng)后,耐藥性并未丟失,MIC結(jié)果保持一致。7.將測(cè)序結(jié)果與金諾芬耐藥菌株的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)后,發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)基因trxB內(nèi)有兩個(gè)不同的點(diǎn)突變。一個(gè)是第13個(gè)堿基的G變?yōu)門,另一個(gè)是第139個(gè)堿基的G變?yōu)锳。結(jié)論1.ARF與SAHA聯(lián)合后對(duì)革蘭陰性菌展現(xiàn)出較好的抗菌活性,為繼續(xù)研究?jī)烧叩捏w內(nèi)模型以及后期臨床試驗(yàn)的準(zhǔn)備做出理論性依據(jù)。2.PMNB與SAHA藥物聯(lián)合在體內(nèi),體外對(duì)MDR革蘭陰性菌展現(xiàn)了良好的抗菌活性,為之后哺乳動(dòng)物模型,臨床試驗(yàn),包括進(jìn)入臨床治療選擇范圍做出重大的突出貢獻(xiàn)。3.我們猜測(cè)PMNB與SAHA藥物聯(lián)合的抗菌機(jī)制,是通過(guò)PMNB破壞細(xì)胞膜,是細(xì)胞失去穩(wěn)定性,幫助SAHA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起大量的ROS的產(chǎn)生,使細(xì)菌死亡。4.兩個(gè)點(diǎn)突變,分別將位于第5個(gè)氨基酸的天冬氨酸改變?yōu)槔野彼?第47個(gè)氨基酸的谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?導(dǎo)致負(fù)電荷的丟失。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 1.1 金諾芬和伏立諾他在革蘭陰性菌中 FICI 的等效分析結(jié)果Figure 1.1 Isobolographic analysis for the FICI of auranofin and vorinostat againstGram-negative bacterial strains.

圖 1.3 金諾芬聯(lián)合伏立諾他對(duì)革蘭陰性菌的時(shí)間殺菌曲線Figure 1.3 Time-kill curves of auranofin combined with vorinostat against Gram-negativebacteria

圖 1.4 多黏菌素 B 聯(lián)合伏立諾他 40 分鐘內(nèi)對(duì)革蘭陰性菌的殺菌曲線Figure 1.4 Time-kill curves of polymyxin B combined with vorinostat against Gram-negativebacteria in 40 min.

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