發(fā)布時間：2020-09-11 15:04

　　 研究目的:近年來由于尿酸堆積在人體內(nèi)而引起的痛風(fēng)等疾病越來越影響人們的身體健康和日常生活,因此及時對體內(nèi)尿酸進(jìn)行檢測對預(yù)防和治療痛風(fēng)、高尿酸血癥等疾病非常必要。目前檢測尿酸的常用方法主要有高效液相色譜法、同位素稀釋質(zhì)譜法、酶法等,前兩種檢測方法存在操作復(fù)雜、儀器昂貴、檢測周期長等缺點(diǎn),不適于尿酸的快速檢測。而酶法檢測尿酸通過尿酸酶催化生成尿囊素,生成的產(chǎn)物與底物濃度成正比,通過測定尿囊素的吸光度值,計算尿酸的濃度,酶法檢測具有特異性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn),但尿酸酶對反應(yīng)條件要求高,無法回收繼續(xù)利用,故而采用酶固定化技術(shù),利用介孔有機(jī)硅中空納米球固定尿酸酶對血清尿酸進(jìn)行測定。研究方法:通過典型的Stober法合成SiO_2納米球,用SiO_2納米球作為硬模板通過一步生長誘導(dǎo)腐蝕法合成介孔有機(jī)硅中空納米球。使用掃描電鏡對合成的SiO_2納米球進(jìn)行表征,使用掃描電鏡、透射電鏡、氮?dú)馕�、紅外光譜、熱重分析對合成的介孔有機(jī)硅中空納米球和固定尿酸酶后的介孔有機(jī)硅中空納米球進(jìn)行表征。用合成好的介孔有機(jī)硅中空納米球?qū)δ蛩崦高M(jìn)行固定,使用正交試驗(yàn)選出固定尿酸酶的最佳條件。通過單因素試驗(yàn)選擇檢測尿酸的最佳的反應(yīng)時間和最適的載體-尿酸酶量,在最佳的反應(yīng)條件下,用介孔有機(jī)硅中空納米球固定后的尿酸酶檢測尿酸,因?yàn)樯傻哪蚰宜嘏c尿酸成正比,所以通過測定290 nm處的尿囊素吸光度值,計算尿酸濃度。研究結(jié)果:SEM和TEM結(jié)果表明,合成的介孔有機(jī)硅中空納米球平均尺寸為380 nm且每個球都是中空的,中空空腔為230 nm,同SiO_2納米球的粒徑大小一致。SiO_2納米球和介孔有機(jī)硅中空納米球均分散良好。介孔有機(jī)硅中空納米球的BET比表面積和孔容分別為592.1 m~2/g和0.29 cm~3/g,介孔有機(jī)硅中空納米球固定尿酸酶后的BET比表面積和孔容分別為47.89 m~2/g和0.059 cm~3/g。介孔有機(jī)硅中空納米球和固定尿酸酶后的介孔有機(jī)硅中空納米球孔徑均為2 nm。熱重分析結(jié)果顯示在100℃~400℃之間,介孔有機(jī)硅中空納米球樣品失重約3%,而介孔有機(jī)硅中空納米球固定尿酸酶后失重達(dá)7%,在400℃以上,介孔有機(jī)硅中空納米球和固定尿酸酶的介孔有機(jī)硅中空納米球都迅速失重,且在400℃~900℃,失重達(dá)7%左右,這部分失重是因?yàn)闃蜻B的有機(jī)硅烷基團(tuán)。尿酸酶的最佳固定時間為8小時,加入的最適尿酸酶體積為2 mL,在最佳固定條件下,尿酸酶的平均固定率在90%以上,固定后尿酸酶的活性與游離酶相比能保持在90%以上。固定后尿酸酶最適的反應(yīng)溫度為40℃,在70℃時尿酸酶的活性仍保持40%以上,最適的pH為8.5,在pH=7-11間較穩(wěn)定。4℃保存3個月后,固定尿酸酶活性與最初相比仍保持90%以上,固定后的尿酸酶檢測尿酸,重復(fù)使用30次后活性仍剩余70%以上,檢測血清尿酸重復(fù)使用40次活性才喪失。通過單因素試驗(yàn)選擇檢測尿酸的最佳的反應(yīng)時間和最適的載體-尿酸酶量,最佳反應(yīng)時間為20 min,加入的最適載體-尿酸酶量為3 mg。在最佳的反應(yīng)條件下,用介孔有機(jī)硅中空納米球固定后的尿酸酶檢測尿酸,通過測定尿囊素在290nm處的吸光度值,計算尿酸濃度。血清尿酸檢測在0.01 mg/mL~1.0 mg/mL的范圍內(nèi)線性良好,檢測限為0.0039 mg/mL,回收率在93.4%~96.2%之間,其日內(nèi)變異率在2.52%~3.05%之間,日間變異率在5.20%~6.87%之間。本法對血清尿酸進(jìn)行檢測的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的尿酸酶紫外法檢測尿酸的結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本的T檢驗(yàn),t=0.007,df=16,p=0.995,p0.05,介孔有機(jī)硅中空納米球固定尿酸酶檢測尿酸與游離尿酸酶的檢測結(jié)果沒有差異。對尿酸檢測結(jié)果進(jìn)行干擾試驗(yàn),尿素、膽紅素和膽酸鈉對尿酸檢測沒有干擾影響,而抗壞血酸對尿酸檢測結(jié)果有干擾。研究結(jié)論:1.通過Stober法合成了單分散的SiO_2納米球,以其作為硬模板通過一步生長誘導(dǎo)腐蝕法合成了內(nèi)部具有中空空腔,孔徑均一可調(diào)、比表面積大、分散性好的介孔有機(jī)硅中空納米球。2.成功地使用介孔有機(jī)硅中空納米球固定了尿酸酶,并對固定后的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定,介孔有機(jī)硅中空納米球固定的尿酸酶pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性良好,酶活性和結(jié)構(gòu)未改變。3.建立了介孔有機(jī)硅中空納米球固定尿酸酶檢測尿酸的方法,在20 min內(nèi)可以完成對尿酸的檢測,該法準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,固定后的尿酸酶檢測尿酸后經(jīng)過離心沉淀后仍可重復(fù)使用。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R446.1;Q814.2

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4 耿

本文編號：2816820