隨著抗生素的濫用,多重耐藥菌株逐漸增多,嚴(yán)重影響感染性疾病的治療。細(xì)菌染色體上的耐藥基因可以在很多種類的移動(dòng)元件的作用下整合到質(zhì)粒上,而質(zhì)�？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)菌間性菌毛的接觸在不同菌種間進(jìn)行傳播。故明確多重耐藥質(zhì)粒中耐藥基因、移動(dòng)元件,闡明耐藥分子遺傳特征十分重要。本文針對(duì)臨床分離的多重耐藥菌株,對(duì)質(zhì)粒介導(dǎo)多重耐藥的機(jī)制進(jìn)行探索研究,具體分為兩個(gè)部分:(1)含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)分析;(2)IncFIB家族多重耐藥質(zhì)粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tetA的測(cè)序和比較基因組學(xué)分析。含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)分析大腸桿菌BTR于2013年分離自北京同仁醫(yī)院一名患者的尿液樣本。通過(guò)VITEK-2自動(dòng)系統(tǒng)和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)主要的ESBLs基因、碳青霉烯類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和常見(jiàn)的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行PCR篩查。使用七個(gè)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型。進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證bla_(NDM-1)在相關(guān)菌株中是否表達(dá),通過(guò)改良Carba NP法檢測(cè)菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其類型。通過(guò)微量肉湯稀釋法檢測(cè)藥物敏感性。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取細(xì)菌基因組,使用“鳥槍法”構(gòu)建全基因組文庫(kù),并在Ion PGM測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。通過(guò)多位點(diǎn)序列分型,大腸桿菌BTR屬于序列型405,并且通過(guò)PCR篩查檢測(cè)到bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、qnrS1、qnrD、erm(B)和mph(A)耐藥基因的存在。bla_(NDM-1)和qnrS1基因可以通過(guò)接合轉(zhuǎn)移方式從菌株BTR共轉(zhuǎn)移到大腸桿菌EC600,產(chǎn)生接合子BTR-NDM-EC600,證明這兩個(gè)耐藥基因位于同一個(gè)質(zhì)粒上,該質(zhì)粒被命名為pNDM-BTR。菌株BTR和接合子BTR-NDM-EC600都產(chǎn)B類碳青霉烯酶,并且都對(duì)氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋新、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星耐藥,但都對(duì)替加環(huán)素、呋喃妥因、磷霉素和多粘菌素敏感。此外,菌株BTR還對(duì)氨曲南、氯霉素、阿奇霉素、慶大霉素和四環(huán)素耐藥。本部分研究共納入分析6個(gè)質(zhì)粒,即IncN1型質(zhì)粒的參考質(zhì)粒R46、所有全測(cè)序且攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒(p LK78、p LK75、pEcNDM1和pNDM-BTR)以及與pNDM-BTR具有最高覆蓋度和一致性的近源質(zhì)粒pMR3-OXA181。每一個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都可以分為保守的IncN1型骨架區(qū)和一些外源插入?yún)^(qū)。保守的IncN1型骨架區(qū)包括了repA和它的iterons、stbABC orfD操縱子、保守上游重復(fù)控制調(diào)節(jié)子區(qū)以及kikA、resP、korB和tra基因。在六個(gè)質(zhì)粒骨架區(qū)不同位點(diǎn)整合了很多外源插入?yún)^(qū)。R46包括一個(gè)多重耐藥區(qū),其由1型整合子In1、ΔTn6309、砷抗性座位arsRDABC orf378、orf657和IS26組成。質(zhì)粒p LK78、pLK75、pEcNDM1和pMR3-OXA181均包括了兩個(gè)外源插入?yún)^(qū):pLK78包括Tn1721殘余和一個(gè)由1型整合子In1021、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的多重耐藥區(qū);pLK75包括In1021-5’和一個(gè)由IS1X2、ecoRII ecoRIImet、In1021-3’和Tn1721殘余組成的多重耐藥區(qū);pEcNDM1包括Tn1721殘余和一個(gè)由1型整合子In1007、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的多重耐藥區(qū);pMR3-OXA181包括Tn3家族新的轉(zhuǎn)座子Tn6361和由1型整合子In191、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的dfrA14區(qū)。pNDM-BTR包括三個(gè)外源插入?yún)^(qū),即IS26、dfrA14區(qū)和Tn3家族新的轉(zhuǎn)座子Tn6360。本部分研究為耐藥基因在IncN1型質(zhì)粒間通過(guò)移動(dòng)元件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移、IncN1型質(zhì)粒的多樣化和進(jìn)化(特別是攜帶bla_(NDM)基因的IncN1型質(zhì)粒)提供了更深入的理解,對(duì)攜帶bla_(NDM)基因的IncN1型質(zhì)粒的流行病學(xué)研究提供了理論依據(jù)。IncFIB家族多重耐藥質(zhì)粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tet A的測(cè)序和比較基因組學(xué)分析肺炎克雷伯菌A1705于2013年分離自沈陽(yáng)盛京醫(yī)院一名患者的尿液樣本。肺炎克雷伯菌911021于2014年分離自重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院一名患者的尿液樣本。肺炎克雷伯菌1642于2014年分離自北京307醫(yī)院一名患者的肺泡灌洗液。通過(guò)VITEK-2自動(dòng)系統(tǒng)和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。對(duì)主要的ESBLs基因、碳青霉烯類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和常見(jiàn)的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行PCR篩查。使用七個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型。使用QIAGEN Plasmid Midi Kit試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)VITEK-2自動(dòng)系統(tǒng)檢測(cè)藥物敏感性。使用Qiagen BloodCell Culture DNA Maxi Kit提取細(xì)菌基因組DNA。針對(duì)菌株1642,構(gòu)建了平均長(zhǎng)度為5k的Nextera Mate Pair大片段文庫(kù),并在Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。針對(duì)菌株A1705和911021,在基于單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)的PacBio RSII測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)多位點(diǎn)序列分型,表明菌株A1705和911021分別屬于序列型449和11,而菌株1642代表了一個(gè)新的序列型2040。通過(guò)PCR篩查,表明肺炎克雷伯菌A1705攜帶bla_(KPC-2)、bla_(NDM-1)、bla_(OXA-1)、qnrS1、oqxAB、tetA(A)、tetA(D)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(TEM-1)和bla_(SHV-33)耐藥基因;肺炎克雷伯菌911021攜帶bla_(KPC-2)、qnrS1、oqxAB、mph(A)、tetA(A)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-11)和bla_(TEM-1)耐藥基因;肺炎克雷伯菌1642攜帶bla_(KPC-2)、qnrS1、mph(A)、tetA(A)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-12)和bla_(CTX-M-14)耐藥基因。菌株A1705、911021和1642中的qnrS1、tetA(A)和bla_(CTXM-14)基因均可以通過(guò)電轉(zhuǎn)化方式共轉(zhuǎn)移到大腸桿菌DH5α,產(chǎn)生電轉(zhuǎn)子A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α,證明這些耐藥基因分別位于同一個(gè)質(zhì)粒上,質(zhì)粒被分別命名為pA1705-qnrS、911021-tetA和1642-tetA。菌株A1705、911021和1642及其各自的電轉(zhuǎn)子,即A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α都對(duì)氨芐西林、復(fù)方新諾明、哌拉西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢呋辛酯、頭孢曲松和慶大霉素耐藥,菌株A1705、911021和1642還對(duì)頭孢替坦、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、呋喃妥因耐藥。此外,菌株911021和1642對(duì)阿米卡星耐藥,但是菌株A1705對(duì)阿米卡星敏感。本部分研究中共納入分析8個(gè)質(zhì)粒,即參考質(zhì)粒pKPN-c22(首次完整測(cè)序的含有基因repA和repB1的質(zhì)粒)、pA1705-qnrS、p911021-tetA、p1642-tetA以及攜帶基因repA和rep B1且和各質(zhì)粒具有最高覆蓋度和一致性的四個(gè)的質(zhì)粒,即pKPN3-307_typeA、pKPN3-307_TypeC、p6234-198.371kb和pKPSH11。每一個(gè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都可以分為骨架區(qū)和大量的外源插入?yún)^(qū)。主要的骨架區(qū)基因包括repA和repB1、umuCD、parAB以及parB的附著位點(diǎn)parC、finO和一系列F型接合轉(zhuǎn)移基因,包括rlx、dtr、cpl、sfx、eex、tivF(tivF1到tivF16、tivF18和tivF19)、traJQ和trbEF。在八個(gè)質(zhì)粒骨架區(qū)不同位點(diǎn)存在許多不同的外源插入?yún)^(qū),尤其是在骨架區(qū)orf312和repB1之間存在一個(gè)巨大的外源插入?yún)^(qū)。該外源插入?yún)^(qū)內(nèi)包括了一個(gè)或兩個(gè)多重耐藥區(qū)。質(zhì)粒pKPN-c22、pKPSH11、p6234-198.371kb、pKPN3-307_TypeC、pKPN3-307_typeA、p911021-tetA和p1642-tetA都含有一個(gè)多重耐藥區(qū),而質(zhì)粒pA1705-qnrS含有兩個(gè)多重耐藥區(qū)。各質(zhì)粒的多重耐藥區(qū)又由很多的移動(dòng)元件組成,比如插入序列、整合子、轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座單元。本部分研究為耐藥基因在Inc FIB家族質(zhì)粒間通過(guò)移動(dòng)元件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移提供了更深入的理解。此外,為臨床多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌,特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌的傳播提供研究依據(jù)�？偨Y(jié)本研究分別對(duì)兩類多重耐藥質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)且全面的描述,包括復(fù)制起始基因、骨架區(qū)和外源插入?yún)^(qū),耐藥基因和移動(dòng)元件,從而闡明了由多重耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機(jī)制,可為多重耐藥菌的研究與防控提供理論支持。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 1.1 標(biāo)記耐藥基因電泳圖Figure 1.1 PCR result of BTR and its related strains1.3.2.3 改良 Carba NP 法使用改良 Carba NP 法檢測(cè)菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其類型，其中底物Ⅰ為陰性對(duì)照；底物Ⅱ?yàn)閬啺放嗄?硫酸鋅；底物Ⅲ為亞胺培南+硫酸鋅+他唑巴坦（他唑巴坦可抑制 A 類酶）；底物Ⅳ為亞胺培南+硫酸鋅+EDTA（EDTA 可抑制 B 類酶）；底物Ⅴ為亞胺培南+硫酸鋅+他唑巴坦+EDTA。如果底物Ⅲ中檢測(cè)孔由紅色變?yōu)槌赛S色且底物Ⅴ中檢測(cè)孔仍為紅色，則為 B 類酶；如果底物Ⅳ中檢測(cè)孔由紅色變?yōu)槌赛S色且底物Ⅴ中檢測(cè)孔仍為紅色，則為 A 類酶；如果底物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中檢測(cè)孔均由紅色變?yōu)槌赛S色，則可能為 D 類酶（可能為 D 或者 A+D 或者 B+D 或者A+B+D，不可區(qū)分），具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1.2：

改良CarbaNP法結(jié)果

第 25 頁(yè)圖 1.3 質(zhì)粒全序圈圖Figure 1.3 Plasmid schematic maps：圖中，最內(nèi)環(huán)表示 GC 偏移量；次內(nèi)環(huán)表示 GC 含量；最外環(huán)表示基因且按功能分顏色表示；次外環(huán)中灰色部分表示質(zhì)粒骨架區(qū)，黑色區(qū)表示外源插入?yún)^(qū)。

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本文編號(hào)：2813318