隨著抗生素的濫用,多重耐藥菌株逐漸增多,嚴(yán)重影響感染性疾病的治療。細(xì)菌染色體上的耐藥基因可以在很多種類的移動元件的作用下整合到質(zhì)粒上,而質(zhì)粒可以通過細(xì)菌間性菌毛的接觸在不同菌種間進(jìn)行傳播。故明確多重耐藥質(zhì)粒中耐藥基因、移動元件,闡明耐藥分子遺傳特征十分重要。本文針對臨床分離的多重耐藥菌株,對質(zhì)粒介導(dǎo)多重耐藥的機制進(jìn)行探索研究,具體分為兩個部分:(1)含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)分析;(2)IncFIB家族多重耐藥質(zhì)粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tetA的測序和比較基因組學(xué)分析。含有In191和Tn6360的pNDM-BTR及其他攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)分析大腸桿菌BTR于2013年分離自北京同仁醫(yī)院一名患者的尿液樣本。通過VITEK-2自動系統(tǒng)和16S rRNA基因測序進(jìn)行菌種鑒定。對主要的ESBLs基因、碳青霉烯類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和常見的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行PCR篩查。使用七個管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)進(jìn)行多位點序列分型。進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗。為了驗證bla_(NDM-1)在相關(guān)菌株中是否表達(dá),通過改良Carba NP法檢測菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其類型。通過微量肉湯稀釋法檢測藥物敏感性。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取細(xì)菌基因組,使用“鳥槍法”構(gòu)建全基因組文庫,并在Ion PGM測序平臺上進(jìn)行高通量測序。通過多位點序列分型,大腸桿菌BTR屬于序列型405,并且通過PCR篩查檢測到bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M)、bla_(TEM)、qnrS1、qnrD、erm(B)和mph(A)耐藥基因的存在。bla_(NDM-1)和qnrS1基因可以通過接合轉(zhuǎn)移方式從菌株BTR共轉(zhuǎn)移到大腸桿菌EC600,產(chǎn)生接合子BTR-NDM-EC600,證明這兩個耐藥基因位于同一個質(zhì)粒上,該質(zhì)粒被命名為pNDM-BTR。菌株BTR和接合子BTR-NDM-EC600都產(chǎn)B類碳青霉烯酶,并且都對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢呋新、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲惡唑和環(huán)丙沙星耐藥,但都對替加環(huán)素、呋喃妥因、磷霉素和多粘菌素敏感。此外,菌株BTR還對氨曲南、氯霉素、阿奇霉素、慶大霉素和四環(huán)素耐藥。本部分研究共納入分析6個質(zhì)粒,即IncN1型質(zhì)粒的參考質(zhì)粒R46、所有全測序且攜帶bla_(NDM)的IncN1型質(zhì)粒(p LK78、p LK75、pEcNDM1和pNDM-BTR)以及與pNDM-BTR具有最高覆蓋度和一致性的近源質(zhì)粒pMR3-OXA181。每一個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都可以分為保守的IncN1型骨架區(qū)和一些外源插入?yún)^(qū)。保守的IncN1型骨架區(qū)包括了repA和它的iterons、stbABC orfD操縱子、保守上游重復(fù)控制調(diào)節(jié)子區(qū)以及kikA、resP、korB和tra基因。在六個質(zhì)粒骨架區(qū)不同位點整合了很多外源插入?yún)^(qū)。R46包括一個多重耐藥區(qū),其由1型整合子In1、ΔTn6309、砷抗性座位arsRDABC orf378、orf657和IS26組成。質(zhì)粒p LK78、pLK75、pEcNDM1和pMR3-OXA181均包括了兩個外源插入?yún)^(qū):pLK78包括Tn1721殘余和一個由1型整合子In1021、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的多重耐藥區(qū);pLK75包括In1021-5’和一個由IS1X2、ecoRII ecoRIImet、In1021-3’和Tn1721殘余組成的多重耐藥區(qū);pEcNDM1包括Tn1721殘余和一個由1型整合子In1007、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的多重耐藥區(qū);pMR3-OXA181包括Tn3家族新的轉(zhuǎn)座子Tn6361和由1型整合子In191、ecoRII ecoRIImet和ΔIS1X2組成的dfrA14區(qū)。pNDM-BTR包括三個外源插入?yún)^(qū),即IS26、dfrA14區(qū)和Tn3家族新的轉(zhuǎn)座子Tn6360。本部分研究為耐藥基因在IncN1型質(zhì)粒間通過移動元件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移、IncN1型質(zhì)粒的多樣化和進(jìn)化(特別是攜帶bla_(NDM)基因的IncN1型質(zhì)粒)提供了更深入的理解,對攜帶bla_(NDM)基因的IncN1型質(zhì)粒的流行病學(xué)研究提供了理論依據(jù)。IncFIB家族多重耐藥質(zhì)粒pA1705-qnrS、p911021-tetA和p1642-tet A的測序和比較基因組學(xué)分析肺炎克雷伯菌A1705于2013年分離自沈陽盛京醫(yī)院一名患者的尿液樣本。肺炎克雷伯菌911021于2014年分離自重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院一名患者的尿液樣本。肺炎克雷伯菌1642于2014年分離自北京307醫(yī)院一名患者的肺泡灌洗液。通過VITEK-2自動系統(tǒng)和16S rRNA基因測序進(jìn)行菌種鑒定。對主要的ESBLs基因、碳青霉烯類耐藥基因、喹諾酮類耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因和常見的四環(huán)素耐藥基因進(jìn)行PCR篩查。使用七個管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)進(jìn)行多位點序列分型。使用QIAGEN Plasmid Midi Kit試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化實驗。通過VITEK-2自動系統(tǒng)檢測藥物敏感性。使用Qiagen BloodCell Culture DNA Maxi Kit提取細(xì)菌基因組DNA。針對菌株1642,構(gòu)建了平均長度為5k的Nextera Mate Pair大片段文庫,并在Illumina MiSeq測序平臺上進(jìn)行高通量測序。針對菌株A1705和911021,在基于單分子實時測序技術(shù)的PacBio RSII測序平臺上進(jìn)行測序。通過多位點序列分型,表明菌株A1705和911021分別屬于序列型449和11,而菌株1642代表了一個新的序列型2040。通過PCR篩查,表明肺炎克雷伯菌A1705攜帶bla_(KPC-2)、bla_(NDM-1)、bla_(OXA-1)、qnrS1、oqxAB、tetA(A)、tetA(D)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-15)、bla_(TEM-1)和bla_(SHV-33)耐藥基因;肺炎克雷伯菌911021攜帶bla_(KPC-2)、qnrS1、oqxAB、mph(A)、tetA(A)、bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-11)和bla_(TEM-1)耐藥基因;肺炎克雷伯菌1642攜帶bla_(KPC-2)、qnrS1、mph(A)、tetA(A)、bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M-65)、bla_(SHV-12)和bla_(CTX-M-14)耐藥基因。菌株A1705、911021和1642中的qnrS1、tetA(A)和bla_(CTXM-14)基因均可以通過電轉(zhuǎn)化方式共轉(zhuǎn)移到大腸桿菌DH5α,產(chǎn)生電轉(zhuǎn)子A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α,證明這些耐藥基因分別位于同一個質(zhì)粒上,質(zhì)粒被分別命名為pA1705-qnrS、911021-tetA和1642-tetA。菌株A1705、911021和1642及其各自的電轉(zhuǎn)子,即A1705-qnrS-DH5α、911021-tetA-DH5α和1642-tetA-DH5α都對氨芐西林、復(fù)方新諾明、哌拉西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢呋辛酯、頭孢曲松和慶大霉素耐藥,菌株A1705、911021和1642還對頭孢替坦、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、呋喃妥因耐藥。此外,菌株911021和1642對阿米卡星耐藥,但是菌株A1705對阿米卡星敏感。本部分研究中共納入分析8個質(zhì)粒,即參考質(zhì)粒pKPN-c22(首次完整測序的含有基因repA和repB1的質(zhì)粒)、pA1705-qnrS、p911021-tetA、p1642-tetA以及攜帶基因repA和rep B1且和各質(zhì)粒具有最高覆蓋度和一致性的四個的質(zhì)粒,即pKPN3-307_typeA、pKPN3-307_TypeC、p6234-198.371kb和pKPSH11。每一個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都可以分為骨架區(qū)和大量的外源插入?yún)^(qū)。主要的骨架區(qū)基因包括repA和repB1、umuCD、parAB以及parB的附著位點parC、finO和一系列F型接合轉(zhuǎn)移基因,包括rlx、dtr、cpl、sfx、eex、tivF(tivF1到tivF16、tivF18和tivF19)、traJQ和trbEF。在八個質(zhì)粒骨架區(qū)不同位點存在許多不同的外源插入?yún)^(qū),尤其是在骨架區(qū)orf312和repB1之間存在一個巨大的外源插入?yún)^(qū)。該外源插入?yún)^(qū)內(nèi)包括了一個或兩個多重耐藥區(qū)。質(zhì)粒pKPN-c22、pKPSH11、p6234-198.371kb、pKPN3-307_TypeC、pKPN3-307_typeA、p911021-tetA和p1642-tetA都含有一個多重耐藥區(qū),而質(zhì)粒pA1705-qnrS含有兩個多重耐藥區(qū)。各質(zhì)粒的多重耐藥區(qū)又由很多的移動元件組成,比如插入序列、整合子、轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座單元。本部分研究為耐藥基因在Inc FIB家族質(zhì)粒間通過移動元件進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移提供了更深入的理解。此外,為臨床多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌,特別是多重耐藥肺炎克雷伯菌的傳播提供研究依據(jù)�？偨Y(jié)本研究分別對兩類多重耐藥質(zhì)粒進(jìn)行了系統(tǒng)且全面的描述,包括復(fù)制起始基因、骨架區(qū)和外源插入?yún)^(qū),耐藥基因和移動元件,從而闡明了由多重耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥機制,可為多重耐藥菌的研究與防控提供理論支持。
【學(xué)位單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R446.5
【部分圖文】：

圖 1.1 標(biāo)記耐藥基因電泳圖Figure 1.1 PCR result of BTR and its related strains1.3.2.3 改良 Carba NP 法使用改良 Carba NP 法檢測菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶及其類型，其中底物Ⅰ為陰性對照；底物Ⅱ為亞胺培南+硫酸鋅；底物Ⅲ為亞胺培南+硫酸鋅+他唑巴坦（他唑巴坦可抑制 A 類酶）；底物Ⅳ為亞胺培南+硫酸鋅+EDTA（EDTA 可抑制 B 類酶）；底物Ⅴ為亞胺培南+硫酸鋅+他唑巴坦+EDTA。如果底物Ⅲ中檢測孔由紅色變?yōu)槌赛S色且底物Ⅴ中檢測孔仍為紅色，則為 B 類酶；如果底物Ⅳ中檢測孔由紅色變?yōu)槌赛S色且底物Ⅴ中檢測孔仍為紅色，則為 A 類酶；如果底物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中檢測孔均由紅色變?yōu)槌赛S色，則可能為 D 類酶（可能為 D 或者 A+D 或者 B+D 或者A+B+D，不可區(qū)分），具體實驗結(jié)果見圖 1.2：

改良CarbaNP法結(jié)果

第 25 頁圖 1.3 質(zhì)粒全序圈圖Figure 1.3 Plasmid schematic maps：圖中，最內(nèi)環(huán)表示 GC 偏移量；次內(nèi)環(huán)表示 GC 含量；最外環(huán)表示基因且按功能分顏色表示；次外環(huán)中灰色部分表示質(zhì)粒骨架區(qū)，黑色區(qū)表示外源插入?yún)^(qū)。

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本文編號：2813318