單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種常見的食源性致病菌。近年來,由該菌引起的食品安全事件頻繁發(fā)生,嚴重威脅著人類的健康和社會經(jīng)濟的發(fā)展。該菌可感染人和動物引發(fā)李斯特菌病。臨床癥狀為腦炎、腦膜炎、敗血癥等,病死率較高。因此,對其進行現(xiàn)場監(jiān)控與快速準確檢測已成為公共衛(wèi)生檢測領(lǐng)域的研究熱點問題之一。目前,單增李斯特菌的實驗室檢測方法,主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)生化鑒定法、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法,這些方法均存在著耗時長、靈敏性低、對實驗條件和操作人員要求較高等不足。因此開發(fā)具有操作簡單、快速、靈敏的單增李斯特菌檢測新方法,對于李斯特菌病的防控工作具有重要的意義。本課題研究旨在依據(jù)單增李斯特菌的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和致病機制,將分子生物學技術(shù),納米技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建針對食品中單增李斯特菌的快速、靈敏、簡便的可視化檢測方法。為環(huán)境生物毒素研究提供新思路和新方法,也為食品安全的現(xiàn)場檢測提供技術(shù)支持。主要研究內(nèi)容包括以下四個部分:第一部分單增李斯特菌雞卵黃抗體IgY的制備及純化鑒定(1)以單增李斯特菌滅活菌懸液,分別制備弗氏完全佐劑疫苗和弗氏不完全佐劑疫苗。采用皮下多點注射法將疫苗接種于雞胸處皮下,收集免疫前后雞蛋,采用聚乙二醇沉淀法提取卵黃抗體,采用凝膠過濾層析法對卵黃抗體IgY進行分離純化,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對所得抗體IgY進行純度鑒定。結(jié)果顯示,純化前的IgY除目標鏈之外出現(xiàn)多條雜帶,純化之后的IgY僅有目標鏈顯現(xiàn),表明純化后抗體純度較高。(2)采用BCA蛋白定量試劑盒測定卵黃抗體蛋白含量。經(jīng)測定所提取IgY的蛋白含量范圍為5.51-22.89mg mL~(-1),第15周所提取的IgY的蛋白含量最高,為22.89 mg·mL~(-1)。(3)采用常規(guī)間接ELISA方法對所提取IgY的抗體滴度和特異性進行測定。結(jié)果顯示,隨著免疫時間的增加,抗體滴度呈逐漸上升趨勢,第9周時,抗體滴度達到最大,即1:512000,隨后趨于平穩(wěn),在第15周后有所下降,但依然處于高水平狀態(tài);特異性結(jié)果表明,所制備卵黃抗體IgY與常見的5種食源性致病菌均沒有交叉反應,特異性高。第二部分基于OPD-AuNPs檢測體系的單增李斯特菌可視化檢測方法研究(1)本部分實驗采用溶劑熱法,合成Fe_3O_4磁性納米粒子,并制備單增李斯特菌適配體標記免疫磁納米探針,作為捕獲探針,以BSA為模板,制備納米酶IgY-BSA-AgNCs免疫探針,作為檢測體系的“信號轉(zhuǎn)導器”,采用檸檬酸鈉還原法,制備AuNPs,作為檢測體系的“顯色信號器”。基于OPD-AuNPs反應和IgY-BSA-AgNCs介導催化氧化OPD反應,建立單增李斯特菌可視化檢測體系。結(jié)果顯示,捕獲探針在0.6 mg時,捕獲效率高達96.1%,IgY-BSA-AgNCs探針為10.0μg mL~(-1),OPD濃度為40 nM時,檢測體系的效果達到最佳。(2)對該檢測體系進行效果評價。靈敏度結(jié)果顯示,該檢測體系對單增李斯特菌檢測時間為40 min,可視化檢測限為1×10 CFU mL~(-1),經(jīng)A525處的紫外吸收值建立的線性擬合曲線為A525nm=0.102lgC+1.014,R~2=0.998,該結(jié)果表明建立的檢測方法具有較好的線性關(guān)系;特異性結(jié)果顯示,該檢測體系與其他4種常見的食源性致病菌之間無交叉反應,特異性強;食品模擬樣結(jié)果顯示,可視化檢測限為5×10 CFU mL~(-1),線性擬合曲線為A525nm=0.144lgC+0.726,R~2=0.914,此結(jié)果表明食品基質(zhì)對該檢測方法的干擾性小,可在食品基質(zhì)中靈敏的檢測目標菌,加標回收實驗結(jié)果顯示,該檢測體系加標回收率為97.4-101.3%,RSD在10%以下,這表明本實驗建立的檢測體系穩(wěn)定性強,精密度較好。相比于同類比色檢測方法,該檢測體系具有高效富集,快速靈敏檢測的優(yōu)勢。第三部分基于CB7-AuNPs檢測體系的單增李斯特菌可視化檢測方法研究(1)本部分制備單增李斯特菌適配體和尿素酶雙標記免疫磁納米探針,作為檢測體系的捕獲探針,以AuNPs作為檢測體系的“信號器”,基于CB7-AuNPs的自主裝作用和尿素酶水解尿素反應建立單增李斯特菌可視化檢測體系。結(jié)果顯示,免疫磁納米探針在0.5 mg時,對目標菌富集效率為90.9%,10μL 0.86μM CB7量時,檢測體系效果最好。(2)對建立的單增李斯特菌可視化檢測體系進行效果評價。結(jié)果顯示,該檢測體系對單增李斯特菌可視化檢測限為1×10 CFU mL~(-1),檢測時間為50 min,以A700/A525比值處理數(shù)據(jù),經(jīng)計算,在1×10-1×10~6 CFU mL~(-1)濃度范圍內(nèi),線性回歸曲線為y=0.0903lgC+0.06798,R~2=0.986,表明本實驗建立的檢測方法具有良好的線性關(guān)系;特異性結(jié)果顯示,該檢測體系將目標菌與其他4種常見的食源性致病菌同時進行檢測,僅在目標菌存在時,顯示陽性結(jié)果,特異性強;食品模擬樣結(jié)果顯示,可視化檢測限為1×10~2 CFU mL~(-1),線性回歸曲線為y=0.1048lgC+0.5541,R~2=0.940,此結(jié)果表明該檢測方法可在食品基質(zhì)中靈敏的檢測目標菌,加標回收實驗結(jié)果顯示,該檢測體系加標回收率為97.2-99.6%,RSD在10%以下,說明本實驗建立的檢測體系穩(wěn)定性好,精密度高。與其他比色檢測方法相比,此檢測體系具有操作簡單,快速靈敏的獨特優(yōu)勢。第四部分基于多色比色法的單增李斯特菌快速檢測方法研究(1)本部分實驗以免疫磁納米探針作為“分離器”,以BSA為模板,制備IgY-BSA-MnO_2免疫探針,作為“信號轉(zhuǎn)換器”,以合成的AuNRs作為多色“信號器”,基于IgY-BSA-MnO_2催化氧化TMB反應和TMB~(2+)-AuNRs刻蝕反應建立多色比色檢測體系。條件優(yōu)化結(jié)果顯示,0.6 mg的免疫磁納米探針,28μg的IgY-BSA-MnO_2免疫探針使檢測體系多色顯示效果最優(yōu)。(2)檢測體系的效果評價結(jié)果顯示,該檢測體系對單增李斯特菌檢測時間為45 min,可視化檢測限為1×10 CFU mL~(-1),以AuNRs縱向LSPR的藍移峰差值做標準曲線,Δλ=61.364lgC-88.539,R~2=0.932;特異性效果評價顯示,所構(gòu)建的多色半定量檢測體系抗雜菌干擾性強;食品模擬樣結(jié)果顯示,在5×10-10~5CFU mL~(-1)范圍內(nèi),線性回歸曲線為Δλ=25.038lgC-31.388,R~2=0.992,這表明該檢測方法可快速靈敏的檢測食品基質(zhì)中的目標菌,該檢測體系加標回收率為97.4-102.4%,RSD在10%以下,精密度較好。本研究首先基于OPD-AuNPs反應和IgY-BSA-AgNCs介導催化氧化OPD反應,建立的單增李斯特菌可視化檢測體系,使其具有捕獲效率高,檢測限低,特異性強,檢測時間短等優(yōu)點;為達到簡便、靈敏、快速檢測單增李斯特菌的目標,本研究進一步以CB7-AuNPs的自主裝作用和尿素酶水解尿素反應建立的單增李斯特菌可視化檢測體系,該體系具有操作簡單,快速,靈敏的優(yōu)良性質(zhì);在此工作基礎(chǔ)上,為實現(xiàn)可視化半定量檢測目標菌的目的,本研究又利用IgY-BSA-MnO_2催化氧化TMB反應和TMB~(2+)-AuNRs刻蝕反應建立多色比色可視化檢測體系。多色的顏色變化和半定量測定目標菌的性質(zhì),使該檢測體系在其他比色檢測方法中,具有可視化半定量目標菌的特點,在半定量檢測目標物方面,具有絕對的優(yōu)勢。
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R155.3;R446.6

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