臨床上監(jiān)測心臟移植急性排斥反應(yīng)需要反復(fù)的心肌活檢,無創(chuàng)評價急性移植排斥反應(yīng)仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究旨在制備一種靶向T淋巴細(xì)胞的納米超聲微泡,并探討T淋巴細(xì)胞靶向超聲分子成像在急性移植排斥反應(yīng)診斷中的價值。本研究包括以下三個部分:第一部分?jǐn)y帶CD3抗體靶向納米微泡的制備以及性質(zhì)評價目的制備攜帶CD3抗體以及同型對照抗體的納米微泡(NBs),對其表征進(jìn)行評價。方法采用薄膜水化-機械振蕩法制備納米超聲造影劑,通過合適的離心轉(zhuǎn)速和離心時間分離出粒徑均一的NBs。使用生物素-親和素-生物素連接法制備出攜帶CD3抗體(NBCD3)或者同型對照抗體的NBs(NBcon),體外評價其形態(tài)、分布、粒徑、電位、濃度、穩(wěn)定性以及造影效果等,并用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測其載抗體情況。結(jié)果(1)通過薄膜水化-機械振蕩法制備出的超聲造影劑為MBs和NBs的混合物,在分離純化NBs的過程中,較長的離心時間會導(dǎo)致NBs濃度下降,但是較高的離心轉(zhuǎn)速并不會使NBs的平均粒徑明顯下降。因此,離心300 rpm,3 min既能夠保證NBs的粒徑相對較小,也能夠維持NBs較高的濃度。(2)制備的載生物素化抗體的NBs為乳白色混懸液,靜置后未見明顯分層。其形態(tài)規(guī)則,粒徑均一。NBCD3和NBcon的粒徑和濃度分別約457.06±52.68 nm,(9.12±0.46)×109個/ml以及460.64±45.51 nm,(9.22±0.63)×109個/ml。二者在粒徑、濃度、電位、PDI等各方面沒有明顯差異。(3)在體外,NBCD3和NBcon均具有良好的粒徑穩(wěn)定性和濃度穩(wěn)定性以及造影效果。(4)流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示超過90%的NBCD3(91.5±3.0%)和NBcon(90.5±3.5%)載有CD3抗體或同型對照Ig G。結(jié)論本研究成功制備出攜帶CD3抗體的靶向納米微泡,其粒徑均一,且具有良好的穩(wěn)定性和造影效果。第二部分?jǐn)y帶CD3抗體靶向納米微泡與T淋巴細(xì)胞粘附實驗?zāi)康尿炞C制備的NBCD3與T淋巴細(xì)胞的靶向粘附效果,并評估其對T淋巴細(xì)胞的毒性。方法應(yīng)用磁珠分選試劑盒(陰選)分選大鼠T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞學(xué)檢測其純度。分別于光學(xué)顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡下觀察NBCD3和NBcon與T淋巴細(xì)胞的粘附情況,并通過流式細(xì)胞學(xué)驗證其結(jié)合的效率。MTT實驗評價NBCD3和NBcon對T淋巴細(xì)胞生存率的影響。結(jié)果(1)流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示磁珠分選所得的細(xì)胞懸液中95%以上的細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞。(2)與NBCD3孵育后,T淋巴細(xì)胞表面見大量的NBCD3粘附,而與NBcon孵育后,幾乎沒有NBcon粘附于T淋巴細(xì)胞表面。流式細(xì)胞學(xué)定量結(jié)果顯示粘附有NBCD3的T淋巴細(xì)胞比例(35.4±9.7%)明顯高于NBcon組(0.33±0.2%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)T淋巴細(xì)胞與不同比例的NBCD3和NBcon孵育后,其存活率未受明顯影響。結(jié)論本研究制備的NBCD3,能夠與T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合,且對T淋巴細(xì)胞無明顯毒性。NBCD3的成功制備使得在后續(xù)動物實驗中實現(xiàn)T淋巴細(xì)胞靶向超聲分子成像成為可能。第三部分?jǐn)y帶CD3抗體靶向納米微泡超聲造影評價大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)目的評價T淋巴細(xì)胞靶向超聲分子成像在診斷大鼠心臟移植急性排斥反應(yīng)中的價值。方法制備大鼠腹腔異位心臟移植模型,分別行NBCD3和NBcon超聲分子成像,并用擊破-再灌注法對局部粘附的超聲信號進(jìn)行定量評價�；铙w成像評估NBs在大鼠體內(nèi)的分布情況,注射Di I標(biāo)記NBCD3取心肌組織做冰凍切片,激光共聚焦顯微鏡下觀察評價NBCD3在移植心臟中的分布。HE染色、免疫組化染色以及Western Blot檢測評價急性移植排斥反應(yīng)的程度以及T淋巴細(xì)胞浸潤情況,并將T淋巴細(xì)胞浸潤程度與超聲分子成像的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果(1)共對33只大鼠(16只同種移植大鼠和17只同系移植大鼠)行超聲分子成像。(2)經(jīng)尾靜脈注射后,NBs迅速分布至全身,主要集中于肝臟和脾臟。(3)注射Di I標(biāo)記NBCD3后,同種移植大鼠心肌間質(zhì)中可見紅色熒光顯示,而同系移植大鼠心肌間質(zhì)中未見明顯紅色熒光顯示。(4)在移植心臟部位,同種移植大鼠NBCD3的信號強度明顯高于NBcon(2.86±2.05 d B vs 0.85±0.47 d B,P0.01),同時也明顯高于同系移植大鼠NBCD3的信號強度(2.86±2.05 d B vs 0.71±0.29 d B,P0.01);而同系移植大鼠NBCD3的信號強度與NBcon的信號強度無明顯差異(0.71±0.29 d B vs 0.69±0.29 d B,P0.05)。(5)NBCD3的信號強度與T淋巴細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)(R2=0.67,P0.01),而NBcon的信號強度與T淋巴細(xì)胞浸潤程度無明顯相關(guān)性(R2=0.03,P0.05)。結(jié)論T淋巴細(xì)胞靶向超聲分子成像能夠診斷急性移植排斥反應(yīng),有望為無創(chuàng)評價急性移植排斥反應(yīng)提供一種新方法。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R654.2;R445.1
【部分圖文】：

3.1.2 納米超聲微泡的分離經(jīng)薄膜水化法制備的磷脂溶液使用時用機械振蕩器振蕩 30 s，獲得微泡（microbubbles, MBs）和 NBs 的混合物，隨后采用離心的方法分離上層粒徑較大的MBs 和下層粒徑較小的 NBs。文獻(xiàn)報道離心轉(zhuǎn)速和離心時間是影響 NBs 分離的兩大主要因素[1-3]。為了獲得粒徑相對較小的 NBs，同時避免材料的浪費，本研究將 MBs和 NBs 的混合物進(jìn)行不同的離心處理，通過比較不同的離心轉(zhuǎn)速和離心時間組合 NBs粒徑和濃度的變化，尋求合適的離心參數(shù)。具體方法如下：(1) 為評價離心時間對 NBs 粒徑和濃度的影響，將離心轉(zhuǎn)速固定為 300 rpm，分別比較離心 1 min, 3 min, 5 min 和 10 min 時 NBs 的粒徑和濃度。(2) 為評價離心轉(zhuǎn)速對 NBs 粒徑和濃度的影響，將離心時間固定為 3 min，分別比較離心 100 rpm, 300 rpm, 500 rpm 和 1000 rpm 時 NBs 的粒徑和濃度。3.2 攜帶生物素化抗體納米超聲微泡的制備

圖 2 機械振蕩前后脂質(zhì)溶液外觀。（A）脂質(zhì)溶液為透明液體；（B）脂質(zhì)溶液機械振蕩后為乳白色混懸液；（C）乳白色混懸液靜置后分為上下兩層。當(dāng)離心轉(zhuǎn)速為 300 rpm 時，隨著離心時間從 1 min 增加到 10 min，NBs 濃度逐漸下降，見圖 3A（P < 0.05）。離心 1 min，3 min，5 min 和 10 min 組 NBs 的平均粒徑分別為 690.86 ±38.85 nm, 453.02 ±18.52 nm, 435.12 ±27.86 nm, 438.54 ±23.04 nm。如圖 3A 所示，3 min，5 min 和 10 min 組 NBs 的平均粒徑均小于 1 min 組（P < 0.05），但三組之間平均粒徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。當(dāng)離心時間為 3 min 時，隨著離心轉(zhuǎn)速從 100 rpm 增加到 1000 rpm，NBs 的濃度也逐漸下降，見圖 3B（P < 0.05）。離心 100 rpm，300 rpm，500 rpm 和 1000 rpm 組的平均粒徑分別為 596.38 ± 32.23 nm，453.02 ± 18.52 nm，445.12 ± 27.23 nm 和395±15.71nm。如圖 3B 所示，隨著離心轉(zhuǎn)速增加，NBs 的平均粒徑逐漸下降（P < 0.05），但是 300 rpm 組和 500 rpm 組 NBs 的平均粒徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

22離心時間和離心轉(zhuǎn)速對 NBs 粒徑和濃度的影響。（A）隨著離心時間的增加徑和濃度均下降，離心 3 min，5 min 和 10 min 組 NBs 的平均粒徑無明顯差min 組比較，P < 0.05。(B) 隨著離心轉(zhuǎn)速的增加，NBs 的粒徑和濃度均下300 rpm和500 rpm組NBs的平均粒徑無明顯差異。&與100 rpm組比較，P 00 rpm 組比較，P < 0.05。Bs 理化性質(zhì)評價

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 劉曉婷;于韜;;靶向微泡造影技術(shù)的研究進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)超聲雜志(電子版);2014年09期

2 肖云彬;賓建國;賓建平;;靶向超聲造影劑的修飾與生物連接技術(shù)[J];中華超聲影像學(xué)雜志;2010年04期

3 紀(jì)麗景;燕翼;賓建平;;靶向超聲微泡靶點和配體的研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志;2009年04期

4 王志剛;;超聲分子影像學(xué)研究進(jìn)展[J];中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2009年06期

本文編號：2810277