【摘要】：細菌性痢疾是一個嚴重危害公共衛(wèi)生健康的全球性問題。在發(fā)展中國家,細菌性痢疾已經(jīng)造成了很大的疾病負擔(dān),估計每年至少有8000萬人感染,主要是兒童。細菌性痢疾在我國的發(fā)病率達每年20.28/10萬,每年病例數(shù)達25萬以上。由于抗生素的長期大量使用,細菌的耐藥問題越來越嚴重,已經(jīng)成為一個亟待解決的全球性問題。近年來,多重耐藥志賀菌成為主要流行菌株,在全球不同地區(qū)廣泛流行和傳播,甚至出現(xiàn)了對頭孢曲松和阿奇霉素耐藥的志賀菌,給臨床治療和公共衛(wèi)生防控工作帶來了極大困難和挑戰(zhàn)。2015年在我國廣西地區(qū)甚至還出現(xiàn)了一起由對頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥宋內(nèi)志賀菌引起的水源性暴發(fā)事件,這引起了我們對這種耐藥表型的極大關(guān)注。目前,國內(nèi)外對頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的研究報道極為少見,國內(nèi)還沒有關(guān)于頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的流行分布規(guī)律的研究。本課題首次開展了頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌在我國的流行分布規(guī)律研究,為今后細菌性痢疾的科學(xué)防控提供了重要參考依據(jù)。本研究的目的是通過志賀菌的耐藥性分析以及結(jié)合流行病學(xué)資料的統(tǒng)計分析,明確頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌在我國的流行分布規(guī)律;通過耐藥基因檢測、質(zhì)粒圖譜、接合轉(zhuǎn)移、Southern雜交和質(zhì)粒測序等分析,揭示我國頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的耐藥機制;通過對我國不同年代和地區(qū)的頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥宋內(nèi)志賀菌代表菌株的基因組測序和系統(tǒng)進化分析,探究其傳播進化規(guī)律以及耐藥基因的轉(zhuǎn)移在傳播進化中作用和意義。本研究通過對實驗室歷年分離鑒定出的4237株志賀菌進行藥敏實驗篩查,共篩查出1327(31.3%)株對頭孢曲松耐藥的志賀菌。由于課題開展早期缺乏志賀菌對阿奇霉素耐藥的標準,根據(jù)文獻報道的mph(A)基因作為介導(dǎo)志賀菌對阿奇霉素耐藥的重要機制,將mph(A)陽性視為阿奇霉素耐藥,我們對mph(A)基因進行了篩查,共篩查出779株(18.4%)mph(A)陽性志賀菌,并且通過部分mph(A)陽性志賀菌對阿奇霉素的藥敏試驗驗證,參考2016年CLSI提出的志賀菌對阿奇霉素的耐藥標準,mph(A)陽性宋內(nèi)志賀菌100%(42/42)對阿奇霉素耐藥(≥32μg/mL),mph(A)陽性福氏志賀菌73.9%(34/46)對阿奇霉素耐藥(≥16μg/mL)。綜合上述分析,本研究共篩查出頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌399株,總檢出率為9.4%;其中頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥宋內(nèi)志賀菌211株,檢出率為11.5%;頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥福氏志賀菌188株,檢出率為7.8%。頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌從2003-2004年就已經(jīng)在我國出現(xiàn),并且呈現(xiàn)不斷上升的流行趨勢,從2003-2004年的0.4%上升到2013-2014年的13.2%。在我國安徽(18.2%)、河南(16.4%)、上海(15.4%)、甘肅(8.4%)、湖北(8.3%)、廣西(6.9%)、山西(5.2%)、北京(4.0%)、四川(3.8%)和新疆(2.9%)10個省市都篩查出了頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌;只有遼寧、云南、貴州和廣東4個省并未篩查得到,可能跟這些地區(qū)收集的志賀菌菌株數(shù)量較少有關(guān)。耐藥性分析顯示,頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌對頭孢他啶、哌拉西林、頭孢哌酮、頭孢唑啉、妥布霉素、慶大霉素、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、氨曲南、氨芐西林和復(fù)方新諾明的耐藥率要高于非共同耐藥志賀菌(P0.05);相反,頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌對四環(huán)素、氯霉素和諾氟沙星的耐藥率要低于非共同耐藥志賀菌(P0.05)。以上結(jié)果表明頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌在我國分布廣泛,呈現(xiàn)不斷上升的流行趨勢,并且在宋內(nèi)志賀菌中的檢出率要明顯高于福氏志賀菌,頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的抗生素耐藥性要明顯高于非共同耐藥志賀菌。因此,我們應(yīng)該加強對頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的流行病學(xué)監(jiān)測,為細菌性痢疾的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。本研究采用常規(guī)PCR方法對399株頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌的耐藥基因進行了檢測,結(jié)果顯示在ESBLs耐藥基因中主要以bla_(CTX-M)(88.7%)為主,其次是bla_(TEM)(65.4%)和bla_(OXA)(41.6%),未檢測出bla_(VIM)。在bla_(CTX-M)中,測序分析結(jié)果顯示主要以bla_(CTX-M-14)(59.9%)為主,其次是bla_(CTX-M-55)(18.1%)和bla_(CTX-M-15)(12.1%)。整合子相關(guān)基因中,IntI2的陽性率高達93.2%,IntI1的陽性率達67.7%,而2類整合子基因盒的陽性率也達到了70.7%。通過對78株bla_(CTX-M)和mph(A)基因陽性的志賀菌進行S1-PFGE和Southern Blot雜交分析,除了1株bla_(CTX-M-15)基因不在質(zhì)粒上和1株bla_(CTX-M-55)基因與mph(A)基因在不同的質(zhì)粒上,其余的菌株中bla_(CTX-M-14)、bla_(CTX-M-55)和bla_(CTX-M-15)基因分別與mph(A)基因同時定位在大小相同的質(zhì)粒上,而且質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移試驗證實這些質(zhì)粒能夠在自然狀態(tài)下水平轉(zhuǎn)移。10株質(zhì)粒的測序分析結(jié)果顯示這些質(zhì)粒的類型包括IncF型(8/10)、IncI(1/10)型和IncB/O/K/Z型(1/10),以IncF型為主;在bla_(CTX-M)基因上游主要存在插入序列ISEcp1,而在mph(A)基因上下游主要存在IS26和IS6100,這些插入序列的存在可能跟bla_(CTX-M)和mph(A)基因的表達、活化或轉(zhuǎn)移有關(guān)。通過以上研究結(jié)果說明攜帶bla_(CTX-M)和mph(A)基因的質(zhì)粒是介導(dǎo)志賀菌對頭孢曲松和阿奇霉素產(chǎn)生共同耐藥的重要機制,并且可能作為細菌種內(nèi)、種間和屬間基因轉(zhuǎn)移的重要機制而導(dǎo)致這些耐藥基因的迅速傳播擴散,對我們今后的細菌性痢疾的防治工作提出了嚴峻挑戰(zhàn)�；陬^孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌在宋內(nèi)志賀菌中較高的檢出率和增長趨勢,本研究主要對宋內(nèi)志賀菌尤其是對頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥的宋內(nèi)志賀菌在我國的傳播進化規(guī)律進行了研究,并探討了耐藥基因的轉(zhuǎn)移在進化中意義,目前總共完成了408株宋內(nèi)志賀菌的全基因組測序,其中包括133株頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥的宋內(nèi)志賀菌和275株非共同耐藥志賀菌。本研究采用Holt實驗室建立的reddog流程進行SNP鑒定,在此基礎(chǔ)上使用最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;使用BEAST軟件預(yù)測SNP的變異速率及祖先分化時間,并利用SRST2軟件進行耐藥基因分析。結(jié)果顯示宋內(nèi)志賀菌在全球進化過程中形成了4個獨特的遺傳分支,而我國的分支主要源于Lineage III,在后期傳播進化過程中逐漸形成了一個獨立的分支,并且廣西地區(qū)的菌株尤其是頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥宋內(nèi)志賀菌的疫情菌株在進化樹上出現(xiàn)了顯著集群現(xiàn)象,形成了一個相對獨立的小分支。貝葉斯系統(tǒng)分化時間推測,1980s年代早期宋內(nèi)志賀菌就已經(jīng)傳入國內(nèi),到了1980s年代后期就已經(jīng)廣泛流行并形成一個相對獨立的大分支,在1990s年代開始逐漸分化成兩個相對獨立的分支。從宋內(nèi)志賀菌系統(tǒng)發(fā)育樹上抗生素耐藥基因的分布上來看,我國的志賀菌分支與國外分支存在明顯差異,耐藥基因種類和數(shù)量明顯多于國外的分支,普遍存在著bla_(TEM)、bla_(CTX-M)型ESBLs耐藥基因和mph(A)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因,并且同時攜帶bla_(CTX-M)和mph(A)基因的菌株在國內(nèi)還形成了相對獨立的小分支,表明這些耐藥基因的轉(zhuǎn)移獲取對我國宋內(nèi)志賀菌的傳播進化發(fā)揮著重要的作用。綜上所述,本研究開展了頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌在我國的流行分布規(guī)律及其耐藥機制的研究,并通過全基因組測序?qū)λ蝺?nèi)志賀菌在我國的傳播進化規(guī)律進行研究,探討了耐藥基因在宋內(nèi)志賀菌微進化過程中的重要意義。以上這些研究結(jié)果為今后細菌性痢疾的監(jiān)測工作具有重要的指導(dǎo)意義,為有效預(yù)防頭孢曲松和阿奇霉素共同耐藥志賀菌引起的公共衛(wèi)生事件以及制定科學(xué)合理的防控策略提供了科學(xué)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R446.5
【圖文】：

圖 1-1 宋內(nèi)和福氏志賀菌對頭孢曲松耐藥率的時間變化趨勢 mph(A)基因篩查及其阿奇霉素藥敏結(jié)果志賀菌 mph(A)基因的篩查結(jié)果顯示（表 1-3）：4237 株志賀菌中 mph(A)基性的菌株一共有 779 株，總陽性率為 18.4%，mph(A)基因的陽性率從 2003-20的 5.9%增至 2013-2014 年的 24.8%；在宋內(nèi)和福氏志賀菌中分別有 440 株和 3 mph(A)陽性菌株，陽性率分別為 24.0%和 14.1%，宋內(nèi)志賀菌中的陽性率要高氏志賀菌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。宋內(nèi)和福氏志賀菌中 mph(A)的率隨時間變化呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢（圖 1-2）。表 1-3 志賀菌 mph(A)基因檢測結(jié)果年份宋內(nèi)志賀菌 福氏志賀菌 總志賀菌n/N 陽性率 n/N 陽性率 n/N 陽性率2003-2004 3/58 5.2% 11/181 6.1% 14/239 5.9%2005-2006 14/120 11.7% 23/359 6.4% 37/479 7.7%

圖 1-2 宋內(nèi)和福氏志賀菌 mph(A)陽性率的時間變化趨勢mph(A)陽性志賀菌對阿奇霉素的藥敏結(jié)果顯示（表 1-4）：42 株 mph(A)陽宋內(nèi)志賀菌，其阿奇霉素的 MIC 值全部大于 32μg/mL；而 46 株 mph(A)陽性氏志賀菌，阿奇霉素 MIC 值小于 8μg/mL 的有 4 株（8.7%），大于 8μg/mL 的2 株（91.3%），大于 16μg/mL 有 34 株（73.9%），大于 32μg/mL 的有 24 株（52.2%考 2016 年 CLSI 提出的志賀菌對阿奇霉素的耐藥標準（宋內(nèi)志賀菌≥32μg/m氏志賀菌≥16μg/mL），mph(A)陽性宋內(nèi)志賀菌 100%（42/42）對阿奇霉素耐ph(A)陽性福氏志賀菌 73.9%（34/46）對阿奇霉素耐藥。表 1-4 mph(A)陽性志賀菌的阿奇霉素耐藥結(jié)果阿奇霉素 MIC 宋內(nèi)志賀菌（株） 福氏志賀菌（株）>2μg/mL 0 1>4μg/mL 0 3>8μg/mL 0 8

第 15 頁圖 1-4 共同耐藥志賀菌檢出率的時間變化趨勢.5 共同耐藥志賀菌的地區(qū)分布全國 14 個省市的共同耐藥志賀菌的檢出情況如表 1-7 所示，共有 10 個省市

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