【摘要】：基因療法的快速發(fā)展給人類多種疾病帶來了治愈的希望,并且在腫瘤治療領(lǐng)域中已成為一種最具有發(fā)展前景的治療手段。然而,如何將治療基因聚集到靶器官進(jìn)行特異性表達(dá),從而達(dá)到提高治療效果降低脫靶效應(yīng)等副作用,一直是限制基因治療臨床應(yīng)用的最重要因素。因此,設(shè)計(jì)并制備高效基因遞送載體實(shí)現(xiàn)治療基因的靶向遞送和有效表達(dá)具有重要意義。在前期研究中,本課題組曾模擬病毒基因傳遞載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),構(gòu)建得到基于多糖的仿生納米囊泡基因傳遞載體。該仿生基因傳遞載體不僅能夠有效避免體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除,在腫瘤組織進(jìn)行富集,而且可以被腫瘤細(xì)胞高效攝取,顯著提高治療基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。但是,如何實(shí)現(xiàn)治療基因的可控性表達(dá)尚未解決�；诖�,本論文結(jié)合前期研究基礎(chǔ),在仿生多糖納米囊泡基因傳遞載體的結(jié)構(gòu)中引入光熱劑Au,設(shè)計(jì)并合成了一種光響應(yīng)性的高生物相容性仿生納米囊泡HTCP-Au,用于實(shí)現(xiàn)腫瘤的可控性基因治療。本論文的研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面:(1)HTCP-Au的合成和體外表征。首先將透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)通過酰胺鍵依次連接12-氨基十二烷酸,L-半胱氨酸(L-cysteine,L-Cys)構(gòu)建得到HA-C_(12)-Cys;接著將聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)連接至HA-C_(12)-Cys的末端得到HTCP,最后利用L-Cys中的巰基與Au進(jìn)行Au-S鍵結(jié)合,構(gòu)建得到HTCP-Au。利用核磁共振氫譜、紅外光譜、元素分析對載體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,通過透射電鏡、動態(tài)激光光散射及圓二色譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HTCP-Au構(gòu)建成功。除此之外,DNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明HTCP-Au具有核酸負(fù)載能力;光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明HTCP-Au具有體外光響應(yīng)能力。(2)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和4T1作為細(xì)胞模型考察HTCP-Au的生物相容性、細(xì)胞攝取、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及光熱轉(zhuǎn)化性能。細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡結(jié)果表明HTCP-Au與HTCP-Au/DNA沒有明顯的細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,HTCP-Au,HTCP-Au/DNA細(xì)胞攝取率在6 h就已達(dá)到95%以上,且細(xì)胞攝取與clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)。光熱轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)顯示,使用808 nm近紅外光照射轉(zhuǎn)染HTCP-Au的乳腺癌細(xì)胞,可以顯著提高細(xì)胞溫度,這進(jìn)一步表明HTCP-Au載體具有光響應(yīng)性。(3)體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)。以荷S180腹水瘤的BLAB/C雌性小鼠為模型考察光響應(yīng)性基因遞送載體HTCP-Au的組織相容性、體內(nèi)分布及光熱轉(zhuǎn)換活性。體外溶血實(shí)驗(yàn)與紅細(xì)胞凝聚實(shí)驗(yàn)顯示,HTCP-Au/DNA在體內(nèi)的溶血率低于5%,未見有明顯的細(xì)胞聚集情況,表現(xiàn)出了良好的血液相容性�；谛∈笱杭案喂δ苌笜�(biāo)、小鼠的體重變化、臟器系數(shù)、病理組織切片、ICP-MS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HTCP-Au具有良好的生物相容性,未見明顯的體內(nèi)毒性。體內(nèi)材料組織分布與小鼠的活體成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果共表明HTCP-Au/DNA主要在肝臟和腫瘤組織蓄積,具有腫瘤靶向性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R450
【圖文】：

8圖 2. 1 HTCP-Au 的合成路線示意圖Figure 2.1 Synthesis procedure of HTCP-Au3.4 質(zhì)子核磁共振波譜稱量 0.0150 g 待測樣品，溶解于 0.55 mL 氘代水，置于核磁管中，采核磁共振氫譜（Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NM3.5 傅里葉紅外光譜稱取約 2 mg 待測樣品粉末，與 100~200 mg KBr 粉末混合研磨，在片制片，使用傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectrometer行樣品光譜采集。3.6 粒徑、電位測定

CP 在不同溶液中的分散性(A)、Au NPs (B)及 HTCP-Au (C)溶液 Dispersibility of HTCP in different solutions (A), Au NPs (B) and Hsolution.核磁共振波譜磁共振氫譜中的質(zhì)子峰及其化學(xué)位移等信息，可以初步L-Cys、PEI 是否成功接枝在多糖骨架上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖，HA-C12-Cys 的核磁譜圖在化學(xué)位移 1.0-1.6 ppm 和 2.9質(zhì)子峰，分別為 12-氨基十二烷酸中的-CH2-CH2--CO-NH-CH2-的質(zhì)子峰，在化學(xué)位移 2.8 ppm 出現(xiàn)的質(zhì)子峰，這表明 HA-C12-Cys 成功構(gòu)建；與 HA-C12-Cys 譜圖在化學(xué)位移 2.5-3.5ppm 處出現(xiàn)新峰，為 PEI 中的-NH-C明 PEI 成功接枝到 HA-C12-Cys。

圖 2. 3 HTCP (a)、HA-C12-Cys (b)、HA (c)的核磁共振氫譜圖Figure 2. 3 The1HNMR spectrum of HTCP(a), HA-C12-Cys (b) and HA(c).4.3 傅里葉紅外光譜利用傅里葉紅外光譜法進(jìn)一步對載體 HTCP-Au 進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2.4。在 HA 的 FT-IR 圖中，3360 cm-1處的吸收峰是 HA 分子內(nèi)羥基通過分或者分子內(nèi)氫鍵締合產(chǎn)生的特征吸收峰；1640 cm-1和 1375cm-1的強(qiáng)銳峰為的特征吸收峰；1227 cm-1和 1150 cm-1處的特征吸收峰為糖環(huán)的特征吸收峰 HA 譜圖相比，HA-C12-Cys 在 1733.31 cm-1處出現(xiàn)新峰，此為 L-Cys 的羧基=O 的特征峰。在波長 2850.23 cm-1和 1462 cm-1處分別出現(xiàn)新的吸收峰，此CH2-CH2-的特征峰，而且 2920.73 cm-1處峰強(qiáng)增加，且峰形變窄。而 HTCP400 cm-1左右出現(xiàn)了新峰，此為 PEI 中的-NH2峰。連接 Au NPs 后，光譜的率明顯降低，但仍保持有原有的特征峰。FT-IR 光譜結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) PEIu NPs 已通過 12-氨基十二烷酸，L-Cys 成功接枝到 HA，構(gòu)建得到納米載TCP-Au。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2802629