【摘要】：基因治療作為一種有效低副作用的癌癥治療手段受到廣泛關(guān)注,安全有效的基因輸送載體是其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。基因輸送載體分為病毒載體和非病毒載體,非病毒載體主要包括陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物以及無機納米顆粒。其中,樹枝狀大分子具有結(jié)構(gòu)精確、尺寸可控、表面官能團豐富等特點,是一種獨特的陽離子聚合物型基因載體。聚酰基硫脲(PATU)樹枝狀大分子是本實驗室自主設(shè)計、高效合成的表面具有大量雙鍵、內(nèi)部含有抑瘤活性基團的樹枝狀大分子,硫脲基團的降銅作用是目前被證實的抑瘤機制之一。擬從“協(xié)同治療”角度,構(gòu)建自身具有抑瘤作用的樹枝狀大分子基因載體,利用PATU非直接殺傷腫瘤的抑瘤機制克服大多數(shù)藥物-基因共輸送體系存在的嚴重細胞毒性影響基因表達的問題,以期達到協(xié)同治療效果最大化。論文第一部分通過巰基-烯Michael加成反應(yīng)得到不同代數(shù)的N,N二甲基半胱胺修飾的 PATU(PATU-DMCA)。第二代-第五代(G2～G5)PATU-DMCA 在低N/P比條件下均能夠有效包載DNA形成粒徑(60～100)nm,電勢(10～20)mV的納米顆粒。在人宮頸癌細胞HeLa上,各個代數(shù)的PATU-DMCA無血清熒光素酶(Luci)轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于傳統(tǒng)樹枝狀大分子聚酰胺胺(PAMAM)一個數(shù)量級,而有血清轉(zhuǎn)染效率與其相當。HeLa細胞上亞細胞分布情況表明PATU-DMCA納米顆�？梢酝ㄟ^“質(zhì)子海綿效應(yīng)”實現(xiàn)溶酶體逃逸,這對于發(fā)揮轉(zhuǎn)染活性是非常有利的。在HeLa腹腔瘤模型中,G4 PATU-DMCA表現(xiàn)出與PAMAM相當?shù)捏w內(nèi)Luci轉(zhuǎn)染效率,而其包載TRAIL治療基因后的治療效果顯著(p0.001),抑瘤率為54.9%。本實驗條件下,PATU-DMCA載體組沒有表現(xiàn)出抑瘤活性,而PATU-DMCA/TRAIL復合物沒有發(fā)揮協(xié)同治療效果。從前期工作中PATU-PEG降銅過程分析,可能原因是腫瘤部位結(jié)合蛋白中的銅比血清銅藍蛋白的銅難奪取,且形成的PATU-DMCA/Cu絡(luò)合物可能無法快速代謝。陽離子脂質(zhì)體/聚合物在非病毒載體中占有主導地位,而較低的轉(zhuǎn)染效率是影響其應(yīng)用的主要問題�；谡撿o電作用形成的陽離子型載體/核酸納米復合物熱力學上非常穩(wěn)定,導致難以有效釋放核酸。除此之外,陽離子型載體不可避免地易吸附血漿蛋白,導致轉(zhuǎn)染效率降低。對此,大量研究致力于表面遮蔽層及細胞微環(huán)境響應(yīng)性設(shè)計減少蛋白吸附以及加快核酸胞內(nèi)釋放,而在非陽離子型載體設(shè)計方面的嘗試較少。論文第二部分利用siRNA 3'末端二醇結(jié)構(gòu)與苯硼酸之間的硼酸酯鍵作用設(shè)計了非正負電荷作用的siRNA輸送體系。通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)反應(yīng)合成得到聚乙二醇-聚丙烯酰胺羥甲基苯硼酸(PEG-PBO)嵌段共聚物,PEG-PBO可以與siRNA自組裝形成粒徑90nm的交聯(lián)體系,進一步加入Ca~(2+)和HPO_4~(2-)離子得到CaP核-PEG殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒,其中PEG遮蔽層可以有效控制CaP生長。PEG-PBO/siRNA/CaP納米復合物具有高達94%的包載效率,低細胞毒性,且中性pH條件下可以保持高穩(wěn)定性。在多種細胞系中,PEG-PBO/siRNA/CaP納米復合物表現(xiàn)出優(yōu)于Lipo2000的綠色熒光蛋白/熒光素酶基因沉默效率和BCL-2 mRNA下調(diào)作用。同時,包載BCL-2 siRNA治療基因的納米復合物在細胞水平具有顯著促凋亡效果且可以有效提高化療藥物吉西他濱/紫杉醇的細胞毒性。內(nèi)吞抑制劑實驗表明PEG-PBO/siRNA/CaP納米復合物主要以網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑進入細胞,到達內(nèi)涵體/溶酶體。在酸性內(nèi)涵體/溶酶體中,pH敏感的硼酸酯鍵發(fā)生斷裂,核殼結(jié)構(gòu)迅速分解,從而鈣離子迅速溶解,導致溶酶體滲透性膨脹破裂,siRNA釋放到細胞質(zhì)中發(fā)揮后轉(zhuǎn)錄沉默活性。嘗試將PEG-PBO/siRNA/CaP體系應(yīng)用于體內(nèi)基因輸送,結(jié)果表明納米復合物血漿清除速度快,無法在腫瘤部位蓄積,導致體內(nèi)幾乎沒有沉默效果。納米復合物在葡萄糖緩沖溶液中的粒徑迅速增大的實驗結(jié)果推測,納米復合物靜脈注射進入血液后,血液中的糖類物質(zhì)的二醇結(jié)構(gòu)會競爭絡(luò)合PEG-PBO,導致納米顆粒很容易散開,很快被肝臟、腎臟清除代謝。同時,羥甲基苯硼酸與CaP納米顆粒之間具有強吸附作用,因此,PEG-PBO也可以作為CaP、DNA共沉淀體系的穩(wěn)定劑,所形成的PEG-PBO/DNA/CaP納米復合物粒徑為200 nm左右,電勢為(-6～-4)mV。細胞毒性實驗表明在有血清培養(yǎng)基中,PEG-PBO/DNA/CaP納米復合物對HeLa和A549細胞幾乎沒有毒性。當Ca~(2+)/HPO_4~(2-)為20時,納米復合物的熒光素酶轉(zhuǎn)染效率達到最大值,其無血清值與PEI相當,有血清值是PEI的100～1000倍。與大多數(shù)陽離子載體不同,納米復合物在有血清條件下的轉(zhuǎn)染效率高于無血清轉(zhuǎn)染值,表現(xiàn)出一定的抗血清性。這一特點在PEG-PBO/siRNA/CaP體系也有體現(xiàn)。體外穩(wěn)定性實驗表明PEG-PBO/DNA/CaP納米顆粒在48h內(nèi)粒徑有所增大,其穩(wěn)定性差于具有硼酸酯鍵絡(luò)合作用的siRNA輸送體系,有待進一步提高。綜上所述,論文對兩種新型大分子基因載體—聚酰基硫脲和PEG-PBO穩(wěn)定化的CaP納米顆�！M行了初步探索,取得了一些積極的結(jié)果,但在發(fā)揮聚�；螂灞旧硪至龌钚院吞岣叻�(wěn)定性方面,兩個體系需要進一步優(yōu)化。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R450
【圖文】：

Ｔｈ？邋Ｊｏｇｒｎａｌ邋ｏｆ邋Ｇ？ｎ？邋Ｍｔｄｉｃｉｎ＊．邋＆邋２０１８邋Ｊｏｈｎ邋Ｗｉｌ？ｙ邋ｏｎｄ邋Ｓｏｎｓ邋Ｕｄ逡逑圖１．１基因治療臨床試驗病例統(tǒng)計［３］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ邋ａｄｄｒｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ｇｅｎｅ邋ｔｈｅｒａｐｙ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｔｒｉａｌｓ逡逑輸送逡逑

陽離子脂質(zhì)體通常會與輔助脂質(zhì)體如ＤＯＰＥ、膽固醇等混合使用以提高逡逑壓縮能力和轉(zhuǎn)染效率。ＤＯＰＥ不僅可以促進脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形成，而且有利于核酸逡逑的溶酶體逃逸，而膽固醇可以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及延長血液循環(huán)時間。（圖１．２）逡逑陽離子脂質(zhì)體一般具有三個功能區(qū)域：（１）極性親水陽離子頭端，用于與核逡逑酸反應(yīng)；（２）疏水性尾端，用于和細胞膜作用；（３）頭尾之間的連接部分。正電逡逑性的頭端通常是胺類，季銨鹽，胍類或者氨基酸。它們決定了脂質(zhì)體和核酸磷酸逡逑基團的作用強弱。較多的胺官能團以及官能團間較大的距離有利于轉(zhuǎn)染，疏水尾逡逑端的長度以及化學結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)染效率影響很大。逡逑Ｎ－［ｌ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｖ）ｐｒ0ｐｙＪ］－ＮｆＮ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ邐１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑（ＤＯＴＭＡ）邐、（ＤＯＰＥＪ逡逑，0逡逑ｌ

陽離子脂質(zhì)體通常會與輔助脂質(zhì)體如ＤＯＰＥ、膽固醇等混合使用以提高逡逑壓縮能力和轉(zhuǎn)染效率。ＤＯＰＥ不僅可以促進脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的形成，而且有利于核酸逡逑的溶酶體逃逸，而膽固醇可以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)以及延長血液循環(huán)時間。（圖１．２）逡逑陽離子脂質(zhì)體一般具有三個功能區(qū)域：（１）極性親水陽離子頭端，用于與核逡逑酸反應(yīng)；（２）疏水性尾端，用于和細胞膜作用；（３）頭尾之間的連接部分。正電逡逑性的頭端通常是胺類，季銨鹽，胍類或者氨基酸。它們決定了脂質(zhì)體和核酸磷酸逡逑基團的作用強弱。較多的胺官能團以及官能團間較大的距離有利于轉(zhuǎn)染，疏水尾逡逑端的長度以及化學結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)染效率影響很大。逡逑Ｎ－［ｌ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｖ）ｐｒ0ｐｙＪ］－ＮｆＮ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ邐１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑（ＤＯＴＭＡ）邐、（ＤＯＰＥＪ逡逑，0逡逑ｌ

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