發(fā)布時間：2020-08-21 21:32

【摘要】：研究目的:研究放療后的胰腺癌細胞釋放的高遷移率族蛋白B1(highmobility group bo x-1 protein,HMGB1)通過HMGB-TLR2/TLR4信號軸對腫瘤干細胞的增殖及自我更新產(chǎn)生的影響,并進一步探討其確切分子機制,從而為胰腺癌的放療增敏、分子治療及生物靶向治療提供新思路,為完善胰腺癌的治療提供有效的實驗基礎及理論依據(jù)。研究方法:(1)采用流式細胞檢測技術(Flow Cytometry,FCM)檢測不同劑量放療后的胰腺癌細胞中CD133~+細胞比例隨時間變化趨勢。Western-Blot檢測不同劑量放療48h后的胰腺癌細胞中CD133、Nanog、Oct4及Sox2等干性相關蛋白的表達變化。(2)Western-Blot及qRT-PCR檢測胰腺癌細胞株(SW1990,Pacn-1,Aspc-1)中HMGB1的蛋白及mRNA表達水平。Western-Blot檢測不同劑量放療后胰腺癌細胞中HMGB1的表達變化以及放療后的細胞培養(yǎng)上清中HMGB1的含量變化。免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測胰腺癌細胞放療后HMGB1的釋放過程。(3)對分別過表達和干擾HMGB1的胰腺癌細胞進行放療,獲取細胞培養(yǎng)上清(s upernatant)用于后續(xù)實驗。采用干細胞培養(yǎng)體系對胰腺癌細胞進行誘導培養(yǎng),使用流式細胞分選術分選出其中的CD133~+細胞。使用不同劑量的重組人HMGB1蛋白(rhHMGB1)及細胞放療后上清分別對胰腺癌CD133~+細胞進行處理,顯微鏡觀察并記錄克隆球大小和數(shù)目。采用qRT-PCR檢測不同處理下細胞干性基因Oc t4、Sox2及Nanog的mRNA表達水平。使用細胞增殖活性檢測試劑盒(Cell cou nting kit-8,CCK-8)檢測不同處理下胰腺癌CD133~+細胞增殖變化。(4)Western-Blot及qRT-PCR檢測胰腺癌細胞中HMGB1受體TLR2/TLR4的表達情況。在高表達TLR2低表達TLR4的細胞中分別干擾TLR2和過表達TLR4,在高表達TLR4低表達TLR2的細胞中分別干擾TLR4和過表達TLR2,Western-Blot檢測其在rhHMGB1處理下干性相關蛋白表達變化;克隆形成實驗檢測其形成克隆能力的變化。(5)Western-Blot檢測經(jīng)rhHMGB1及放療上清處理后的胰腺癌CD133~+細胞中Wnt信號通路相關蛋白的表達變化。研究結果:(1)流式細胞術結果及Western-Blot結果顯示,胰腺癌細胞在放療后CD133~+細胞比例及干性蛋白的表達均有所增高,并且與放療劑量和放療后時間存在相關關系,在4Gy放療劑量、放療后48h干性指標增加最明顯。(2)Western-Blot及qRT-PCR結果顯示不同胰腺癌細胞株內HMGB1表達水平不同,放療后均有HMGB1釋放。(3)成球實驗及qRT-PCR結果顯示CD133~+細胞在不同濃度rhHMGB1處理后干性明顯增強,HMGB1~+-SUP處理時亦能增強其干性,HMGB1~--SUP處理下干性無無明顯增強;CCK-8結果顯示rhHMGB1(150ng/ml)及HMGB1~+-SUP處理能夠增強CD133~+細胞增殖能力。(4)Western-Blot及qRT-PCR結果顯示SW1990細胞屬于TLR2受體相對高表達TLR4受體相對低表達細胞,Aspc1細胞與之相反,PANC1細胞屬于TLR2/4受體中等表達細胞;在SW1990細胞中干擾TLR2或過表達TLR4均能降低其干性蛋白的表達,在Aspc1細胞中干擾TLR4或過表達TLR2均能提高其干性相關蛋白的表達,成球實驗亦驗證了成球能力的類似改變。(5)Western-Blot結果表明HMGB1對胰腺癌細胞干性的影響是通過Wnt/β-catenin通路起作用的。結論:(1)體外胰腺癌細胞放療后釋放的HMGB1可以提高殘存細胞干性比例。(2)外源性HMGB1和細胞放療后上清可以提高胰腺癌干細胞自我更新的能力。(3)HMGB1通過TLR2/TLR4受體調控Wnt/β-catenin信號通路,從而調控胰腺癌干細胞自我更新能力。為解決臨床治療中胰腺癌對放療不敏感、易復發(fā)轉移等問題提供了理論基礎。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.9;R730.55
【圖文】：

江蘇大學碩士學位論文2.3 結果2.3.1 放療后胰腺癌細胞干性增強流式細胞結果顯示：人胰腺癌細胞株（SW1990、Panc1、Aspc1）細胞經(jīng)過不同劑量放療，在放療后的不同時間點，細胞中的 CD133+細胞比例不同，在 4Gy放療后 48 小時，CD133+細胞比例比對照組及其他組有較明顯升高，該現(xiàn)象在SW1990 與 Panc1 細胞比 Aspc1 細胞更為明顯；對 Nanog、OCT4、SOX2 蛋白表達水平的檢測結果表明：在三種胰腺癌細胞中，4Gy 放療后 48 小時上述蛋白表達水平明顯增高（圖 2.1）。

盞嫉?HMGB1 在胰腺癌干細胞干性維持中的作用研究22C.D）；免疫熒光結果同樣顯示放療后細胞內 HMGB1 從核內釋放至細胞外（圖2.2 F），統(tǒng)計學結果顯示*P< 0.05 ，**P< 0.01，***P< 0.001 時有統(tǒng)計學意義。(A)(B)Western-blot 及 qRT-PCR 檢測胰腺癌細胞中 HMGB1 基礎表達量(C)(D)Western-blot 檢測不同放療劑量及放療后時間下細胞內 HMGB1 表達量變化(E)對 D 圖的定量結果（左）及 ELISA 檢測放療后不同時間點內上清送 HMGB1 含量(F)免疫熒光檢測放療后細胞內 HMGB1 釋放情況圖 2.2 放療導致細胞內 HMGB1 釋放至細外Fig2.2 Radiation increased HMGB1 expression and induce

法吸凈原有培養(yǎng)基；②將混勻的 CCK8 試劑與培養(yǎng)基按 100μL/孔加入 96 孔板中，輕輕搖晃混勻，注意不要產(chǎn)生任何氣泡，將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱，靜置 2 小時；③使用酶標儀檢測每孔中 450nm 及 490nm 處的分光光度值；⑤數(shù)據(jù)處理：將實驗數(shù)據(jù)減去空白對照組的本底值，再與 0 小時基礎值進行比較，計算得到細胞相對增殖率數(shù)據(jù)。3.3 結果3.3.1HMGB1 穩(wěn)定敲除效率檢測Western-blot 及 qRT-PCR 結果顯示，穩(wěn)定轉染干擾 HMGB1 質粒后，三種胰腺癌細胞 SW1990、Panc1 及 Aspc1 細胞中 HMGB1 蛋白及 mRNA 水平均明顯減低（圖 3.1 A.B）；酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）結果顯示，穩(wěn)定轉染干擾 HMGB1質粒后，8Gy 放療后 48 小時檢測細胞上清中 HMGB1 含量顯著減低（圖 3.1 C）；統(tǒng)計學結果顯示*P< 0.05 ，**P< 0.01，***P< 0.001 時有統(tǒng)計學意義。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 郜明;吳家明;陸茵;;腫瘤微環(huán)境與腫瘤的惡變[J];癌變.畸變.突變;2008年05期

本文編號：2799885