發(fā)布時間：2020-08-21 09:43

【摘要】：背景惡性腫瘤是臨床高發(fā)疾病,其發(fā)生率和死亡人數(shù)不斷增加,嚴(yán)重威脅著人類生命健康,早期發(fā)現(xiàn)對腫瘤的治療效果影響深遠(yuǎn)。影像技術(shù)的大力發(fā)展使影像學(xué)檢查方法在惡性腫瘤診斷中發(fā)揮著其他實(shí)驗(yàn)室檢查方法不可替代的作用,其能無創(chuàng)診斷體內(nèi)腫瘤的位置和大小。超聲檢查是目前臨床診斷惡性腫瘤常用的影像學(xué)方法之一,其具有實(shí)時動態(tài)顯像、安全無放射性、操作方便簡單等優(yōu)點(diǎn)。但常規(guī)超聲檢查僅能發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤的解剖結(jié)構(gòu)和血流動力學(xué)的改變,尚不能早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤中分子表達(dá)水平的變化,故不能真正實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的早期診斷。超聲造影技術(shù)是超聲領(lǐng)域的第三次革命,靜脈注射超聲造影劑后,能顯著增強(qiáng)腫瘤病灶與周圍正常組織的超聲顯像對比度,從而提高惡性腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。但目前臨床上使用的超聲造影劑僅能在腫瘤組織的血管內(nèi)增強(qiáng)超聲顯像,尚不能進(jìn)入腫瘤組織血管外間隙中增強(qiáng)超聲顯像。由于腫瘤組織中存在滲透和滯留增強(qiáng)(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng),故納米級超聲造影劑能穿過腫瘤血管聚集在腫瘤組織間隙中,從而能實(shí)現(xiàn)腫瘤的血管外超聲顯像。納米泡是一種新型的納米級超聲造影劑,在其表面連接針對腫瘤組織血管外靶分子的特異性配體,能進(jìn)一步提高納米泡在腫瘤血管外組織間隙中的聚集和結(jié)合能力,靶向增強(qiáng)腫瘤的超聲顯像,活體內(nèi)有效監(jiān)測腫瘤組織血管外間隙中分子表達(dá)水平的變化,從而提高惡性腫瘤早期診斷和預(yù)后評估的準(zhǔn)確性。碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CAIX)在多種腫瘤(如肺癌、腎癌、宮頸癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸部腫瘤等)細(xì)胞膜上高度表達(dá),是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要蛋白分子。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建針對CAIX的分子探針能實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的分子顯像,且抑制CAIX活性能實(shí)現(xiàn)惡性腫瘤的靶向治療。我們前期研究分別將抗CAIX的單克隆抗體和納米抗體連接到納米泡表面,構(gòu)建出針對腎癌的靶向納米泡,并證實(shí)與空白納米泡相比,其體外能與腎癌786-O細(xì)胞特異性結(jié)合,且在體內(nèi)裸鼠移植瘤模型上具有更強(qiáng)的增強(qiáng)超聲顯像強(qiáng)度。但是相關(guān)研究僅局限于腎癌的超聲分子顯像,且僅研究其在移植瘤組織中的增強(qiáng)超聲顯像效果,尚未深入研究靶向納米泡在多種腫瘤組織中超聲分子顯像的規(guī)律及形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。多肽是由α-氨基酸以肽鍵的方式連接構(gòu)成的氨基酸序列,其分子量小、化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、分布廣泛、免疫原性低,已在分子診斷和藥物治療中得到廣泛的應(yīng)用。多肽PGLR-P1是針對CAIX蛋白多糖區(qū)的特異性配體,故將PGLR-P1連接到脂質(zhì)納米泡上構(gòu)建出的靶向納米泡能使來源于多種器官的惡性腫瘤靶向增強(qiáng)超聲顯像,實(shí)時監(jiān)測腫瘤組織中CAIX的表達(dá)水平,從而有利于多種惡性腫瘤早期診斷準(zhǔn)確性的提高。相關(guān)研究表明多肽介導(dǎo)的靶向超聲造影劑反復(fù)注射后易引起機(jī)體免疫反應(yīng),故其臨床應(yīng)用受限。而適體是一種與生物大分子或細(xì)胞特異性結(jié)合的RNA或單鏈DNA序列,其具有結(jié)構(gòu)多樣、作用范圍廣、易于修飾、無免疫原性等優(yōu)勢,已在分子識別、實(shí)驗(yàn)診斷和疾病治療中發(fā)揮重要的作用。因此,構(gòu)建出粒徑小、安全性高、特異性強(qiáng),且適體介導(dǎo)的靶向超聲造影劑,并研究其在體內(nèi)超聲分子顯像的效果和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)將是我們進(jìn)一步深入探索的內(nèi)容�；谏鲜鲅芯楷F(xiàn)狀,我們從兩個部分分別進(jìn)行基于CAIX的靶向納米泡在惡性腫瘤中實(shí)現(xiàn)超聲分子顯像的實(shí)驗(yàn)研究,首先構(gòu)建攜載CAIX多肽的靶向納米泡,并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中研究其結(jié)合CAIX表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞的能力及增強(qiáng)CAIX表達(dá)陽性移植瘤超聲顯像的效果與規(guī)律;其次針對攜載CAIX多肽的靶向納米泡的不足,將CAIX適體偶聯(lián)在納米泡表面構(gòu)建出適體介導(dǎo)的靶向納米泡,探討其在移植瘤組織中靶向增強(qiáng)超聲顯像的能力及形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。目的1.研究攜載CAIX多肽的靶向納米泡體外特異性結(jié)合CAIX表達(dá)陽性腫瘤細(xì)胞和體內(nèi)增強(qiáng)CAIX表達(dá)陽性移植瘤超聲顯像的能力,探索其在不同類型移植瘤組織中分布差異的原因,為多種惡性腫瘤超聲分子顯像提供一種小型化、增強(qiáng)超聲顯像效果好的新型靶向超聲造影劑,也為靶向造影劑實(shí)現(xiàn)來源于不同器官的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞超聲分子顯像提供研究方法。2.針對攜載CAIX多肽的靶向納米泡的不足,研究偶聯(lián)CAIX適體的靶向脂質(zhì)納米泡與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合能力和靶向增強(qiáng)超聲顯像的效果,深入探討靶向納米泡在體內(nèi)增強(qiáng)超聲顯像的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),不僅為惡性腫瘤超聲分子顯像提供安全性高、特異性強(qiáng)的超聲分子探針,同時也為靶向納米泡診斷惡性腫瘤奠定詳實(shí)的研究基礎(chǔ)。方法1.攜載CAIX多肽的靶向納米泡增強(qiáng)惡性腫瘤超聲顯像的研究(1)化學(xué)固相合成法合成CAIX多肽PGLR-P1,機(jī)械震蕩法制備脂質(zhì)納米泡,通過生物素-親和素法將CAIX多肽連接到脂質(zhì)納米泡表面制備靶向納米泡,熒光標(biāo)記證實(shí)靶向納米泡表面攜載CAIX多肽,并評價(jià)靶向納米泡的粒徑、電位、形態(tài)、分布、細(xì)胞毒性及穩(wěn)定性。(2)光學(xué)顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測靶向和空白納米泡體外結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力,并在瓊脂糖模型中分析兩種納米泡體外增強(qiáng)超聲顯像效果、增強(qiáng)超聲顯像衰減速度以及高機(jī)械指數(shù)的超聲波對靶向納米泡增強(qiáng)超聲顯像強(qiáng)度的影響。(3)構(gòu)建裸鼠腎癌786-O、宮頸癌HeLa和胰腺癌BxPC-3細(xì)胞移植瘤模型,比較靶向和空白納米泡在移植瘤組織中的增強(qiáng)超聲顯像效果(達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度、持續(xù)時間及曲線下面積),并對比分析兩種納米泡在肝腎組織中的增強(qiáng)超聲顯像效果。(4)組織免疫熒光技術(shù)觀察靶向納米泡在移植瘤組織和肌肉組織中的分布情況,免疫組織化學(xué)染色檢測移植瘤組織的CAIX表達(dá)情況,并分析靶向納米泡在不同移植瘤組織中分布差異的原因。2.CAIX適體介導(dǎo)的靶向納米泡在惡性腫瘤超聲分子顯像中的研究(1)體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選出針對CAIX蛋白的單鏈DNA適體,高通量測序分析CAIX適體的序列,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞水平CAIX適體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性。(2)在脂質(zhì)納米泡的基礎(chǔ)上,應(yīng)用硫醇-馬來酰亞胺法制備偶聯(lián)CAIX適體的靶向納米泡,熒光標(biāo)記驗(yàn)證其偶聯(lián)CAIX適體的能力,并評價(jià)其基本表征及細(xì)胞毒性,體外模型中比較靶向和非靶向納米泡增強(qiáng)超聲顯像的能力。(3)激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞水平觀察靶向和非靶向納米泡與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合情況,在荷瘤裸鼠中比較靶向和非靶向納米泡增強(qiáng)移植瘤超聲顯像的能力(達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度和曲線下面積),小動物活體熒光成像進(jìn)一步評估靶向納米泡在移植瘤組織中的聚集能力。(4)冰凍切片上研究靶向納米泡在移植瘤組織血管內(nèi)外的分布情況、偶聯(lián)CAIX適體的能力及結(jié)合腫瘤細(xì)胞的能力,HE染色觀察移植瘤的組織學(xué)特點(diǎn),蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot,WB)檢測移植瘤組織CAIX蛋白的表達(dá)情況,并闡明靶向納米泡在惡性腫瘤中實(shí)現(xiàn)超聲分子顯像的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。結(jié)果1.攜載CAIX多肽的靶向納米泡增強(qiáng)惡性腫瘤超聲顯像的研究(1)成功合成了CAIX多肽PGLR-P1,制備的靶向納米泡表面均勻攜載CAIX多肽,其粒徑為503.7±78.5 nm,且具有分布均勻、形態(tài)規(guī)則、穩(wěn)定性高和細(xì)胞毒性低的優(yōu)點(diǎn)。(2)靶向納米泡體外與786-O和HeLa細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合,而不結(jié)合BxPC-3細(xì)胞,且空白納米泡與三種腫瘤細(xì)胞均不結(jié)合。兩種納米泡的體外超聲造影顯像效果和衰減速度無顯著差異(P0.05),且高機(jī)械指數(shù)超聲輻照后,靶向納米泡的超聲造影顯像強(qiáng)度顯著降低(P0.05)。(3)靶向和空白納米泡在裸鼠肝腎組織中超聲造影顯像的達(dá)峰時間、峰值強(qiáng)度和持續(xù)時間均無顯著差異(P0.05)。在786-O和HeLa移植瘤組織中,靶向納米泡的增強(qiáng)超聲顯像效果和空白納米泡有顯著差異,其具有更高的峰值強(qiáng)度、更長的持續(xù)時間和更大的曲線下面積(P0.05);而兩種納米泡的增強(qiáng)超聲顯像效果在BxPC-3移植瘤組織中無顯著差異(P0.05)。(4)靜脈注射靶向納米泡后,其能分布于移植瘤組織血管內(nèi)外,且在786-O和HeLa移植瘤組織中的數(shù)量顯著多于其在BxPC-3移植瘤組織中,而在肌肉組織中僅能分布于血管內(nèi)。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)786-O和HeLa移植瘤組織表達(dá)CAIX,而BxPC-3移植瘤組織不表達(dá)CAIX,故移植瘤組織中CAIX表達(dá)的差異導(dǎo)致了靶向納米泡的分布差異。2.CAIX適體介導(dǎo)的靶向納米泡在惡性腫瘤超聲分子顯像中的研究(1)篩選出針對CAIX蛋白的特異性單鏈DNA適體,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)均證實(shí)CAIX適體對786-O和HeLa細(xì)胞具有良好的特異性結(jié)合能力,但與BxPC-3細(xì)胞無結(jié)合能力,且等長度的無義適體均不結(jié)合三種腫瘤細(xì)胞。(2)CAIX適體均勻分布于靶向納米泡表面,且靶向納米泡粒徑小、分布均勻、大小相近、安全性高。體外靶向納米泡和偶聯(lián)無義適體的非靶向納米泡的增強(qiáng)超聲顯像效果無顯著差異(P0.05)。(3)體外靶向納米泡特異性聚集在786-O和HeLa細(xì)胞周圍,而未聚集在BxPC-3細(xì)胞周圍,且非靶向納米泡均未聚集在三種腫瘤細(xì)胞周圍。與非靶向納米泡相比,靶向納米泡在786-O和HeLa移植瘤組織中的增強(qiáng)超聲顯像具有更高的峰值強(qiáng)度和更大的曲線下面積(P0.05),而兩者在BxPC-3移植瘤組織中的增強(qiáng)超聲顯像效果無顯著差異(P0.05)。小動物活體熒光成像顯示靶向納米泡特異性聚集在786-O和HeLa移植瘤組織中。(4)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)分布在移植瘤組織血管外間隙中的靶向納米泡仍能穩(wěn)定偶聯(lián)CAIX適體,且在786-O和HeLa移植瘤組織中的靶向納米泡數(shù)量顯著多于非靶向納米泡,而靶向和非靶向納米泡在BxPC-3移植瘤組織中的數(shù)量無顯著差異。WB顯示CAIX在786-O和HeLa移植瘤組織中高表達(dá),而在BxPC-3移植瘤組織中不表達(dá),故在CAIX適體的介導(dǎo)下,靶向納米泡能特異性增強(qiáng)移植瘤的超聲顯像。結(jié)論1.攜載CAIX多肽的靶向納米泡在體外能與CAIX表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合,在體內(nèi)能靶向增強(qiáng)CAIX表達(dá)陽性移植瘤的超聲顯像,為來源于不同器官的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞超聲分子顯像提供了一種全新的靶向超聲造影劑。2.偶聯(lián)CAIX適體的靶向納米泡具有體外特異性聚集在多種腫瘤細(xì)胞周圍的能力,并在腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞超聲分子顯像中具有良好的顯像效果,為適體介導(dǎo)的靶向超聲造影劑增強(qiáng)腫瘤的超聲顯像提供了實(shí)驗(yàn)方法和研究基礎(chǔ)。3.靜脈注射后,靶向納米泡能通過腫瘤的EPR效應(yīng)擴(kuò)散至移植瘤組織間隙中,在其表面的特異性配體作用下,靶向結(jié)合表達(dá)特定靶分子的腫瘤細(xì)胞,顯著增強(qiáng)腫瘤的超聲顯像,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞的超聲分子顯像。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R445.1;R730.44
【圖文】：

圖 2-1 CAIX 多肽的質(zhì)譜分析。（A）生物素化多肽的質(zhì)譜圖，（B）FITC 標(biāo)記的生物素化多肽的質(zhì)譜圖。2.3.2 靶向納米泡的表征檢測靶向和空白納米泡的濃度分別是(10.70±0.82)x108/ml 和(11.53±0.81)x108/ml，兩者的濃度無顯著差異（P>0.05）。Zetasizer Nano ZS90 檢測儀結(jié)果顯示靶向和空白納米泡的粒徑分別為 503.7±78.5 nm 和 428.1±41.8 nm（圖 2-2 A 和 B）�？瞻准{米泡的電位為-19.27±2.21 mV，其原因是制備空白納米泡的脂質(zhì)成分中含有陰離子磷脂 DPPA[101]。靶向納米泡的電位為-14.80±2.12 mV，表明 CAIX 多肽т氨基基團(tuán)的正電荷能部分中和陰離子磷脂的負(fù)電荷，也間接證實(shí)靶向納米泡т攜載 CAIX 多肽[102]。靶向納米泡的負(fù)電位有利于其通過靜電排斥維持穩(wěn)定性。光學(xué)顯微鏡н，靶向納米泡分布均勻、粒徑大小相近，無明顯的聚集和破滅現(xiàn)象，穩(wěn)定性好（圖 2-2 C）。透射電鏡н，靶向納米泡呈規(guī)則黑色圓形，邊界清楚，粒徑在 500nm 左右，其у Zetasizer Nano ZS90 檢測儀的測量結(jié)果相 致（圖 2-2 D）。使用腎癌 786-O 細(xì)胞進(jìn)行 MTT 試驗(yàn)，評估靶向和

納米泡的物理表征及細(xì)胞毒性。（A）靶向納米泡的粒徑分布圖，（B）空白（C）光學(xué)顯微鏡н觀察靶向納米泡的分布，（D）透射電鏡н觀察靶向納泡的細(xì)胞毒性評價(jià)，*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者之間有顯著差異（P<0.05）。光共聚焦顯微鏡н，DiI 標(biāo)記的靶向納米泡脂質(zhì)膜顯示為紅色熒光（使靶向納米泡表面攜載的 CAIX 多肽顯示為綠色熒光（圖 2-3 B）重疊（圖 2-3 C），直接證實(shí)靶向納米泡表面攜載 CAIX 多肽。п白納米泡和攜載無熒光標(biāo)記的 CAIX 多肽的靶向納米泡均未顯示

圖 2-2 納米泡的物理表征及細(xì)胞毒性。（A）靶向納米泡的粒徑分布圖，（B）空白納米泡的粒徑分布圖，（C）光學(xué)顯微鏡н觀察靶向納米泡的分布，（D）透射電鏡н觀察靶向納米泡的形態(tài)，（E）納米泡的細(xì)胞毒性評價(jià)，*表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者之間有顯著差異（P<0.05）。在激光共聚焦顯微鏡н，DiI 標(biāo)記的靶向納米泡脂質(zhì)膜顯示為紅色熒光（圖 2-3 A），F(xiàn)ITC 標(biāo)記使靶向納米泡表面攜載的 CAIX 多肽顯示為綠色熒光（圖 2-3 B），щ兩種熒光可完全重疊（圖 2-3 C），直接證實(shí)靶向納米泡表面攜載 CAIX 多肽。п攜載 CAIX多肽的空白納米泡和攜載無熒光標(biāo)記的 CAIX 多肽的靶向納米泡均未顯示綠色熒光。

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本文編號：2799221