【摘要】：第一部分基于先證者醫(yī)學外顯子組測序技術檢測分析DSD患者的致病基因變異目的:性發(fā)育障礙(Disorders of sex development,DSD)是一大類以染色體異常、性腺或解剖結構發(fā)育不典型為特征的異質性疾病,大多數(shù)特定類型DSD發(fā)病率在1/100,000以下。其發(fā)病機制復雜,臨床確診率低。高通量測序技術憑借其大規(guī)模并行快速檢測的優(yōu)勢極大地提高了遺傳病的分子診斷效率。本研究旨在應用先證者醫(yī)學外顯子組測序技術(proband-only medical exome sequencing,POMES)檢測中國DSD患者的基因變異,評估其在DSD診斷中的臨床應用價值。方法:1.根據DSD納入及排除標準,收集患者臨床資料并按染色體核型分類;2.采集患者及其家系成員的DNA樣本,對先證者行高通量測序,包括文庫建立、雜交、富集捕獲、上機測序等流程;3.根據測序深度等參數(shù)評估數(shù)據質量,通過Ingenuity軟件對變異進行篩選;4.候選基因變異應用Sanger測序驗證后按美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會指南評估致病性,并將數(shù)據結果進一步統(tǒng)計分析。結果:1.納入的88例先證者根據染色體核型分為46,XY DSD(68/88,77.3%)和46,XX DSD(20/88,22.7%),就診年齡以9~14歲最多見;2.測序數(shù)據經過濾分析、驗證后,47例患者檢測到候選變異(53.4%,47/88),以SRD5A2和AR基因變異最為常見;3.檢測到的54個變異中27個為新發(fā)現(xiàn)的變異,變異類型包括錯義、無義、移碼、剪接位點、閱讀框內插入/缺失及拷貝數(shù)變異,其中致病性變異和可能致病性變異分類分別占44.4%(24/54)和25.9%(14/54);4.46,XY DSD和46,XX DSD的診斷率分別為45.6%(31/68)和20%(4/20)。結論:1.本部分研究統(tǒng)計了中國人群DSD患者的發(fā)病情況,豐富了中國人群罕見DSD的基因譜、突變譜以及表型譜;2.POMES技術結合規(guī)范化變異分類可作為46,XY DSD患者的臨床一線診斷策略。第二部分1型Leydig細胞發(fā)育不全患者的分子遺傳學分析目的:睪丸間質細胞發(fā)育不全(Leydig cell hypoplasia,LCH)是46,XY DSD的罕見病因之一,由黃體生成素/絨毛膜促性腺激素受體(luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor,LHCGR)基因失活變異所引起。本部分研究旨在分析總結LCH患者的臨床資料及分子遺傳學特征。方法:1.收集并分析LCH先證者的臨床資料,檢測血清相關激素指標,行激素激發(fā)試驗等;2.POMES技術結合Sanger測序分析驗證患者基因組變異;3.應用CRYP-SKIP和BDGP預測軟件并結合蛋白質的功能結構域,分析評估變異的致病性;4.對先證者手術切除后的異常性腺組織行病理學分析。結果:1.先證者的臨床特征主要表現(xiàn)為外生殖器外觀與染色體核型不符、腹股溝疝,伴有低水平血清基礎睪酮和雙氫睪酮且對絨毛膜促性腺激素激發(fā)無反應;2.基因檢測表明患者LHCGR基因存在兩個未被報道過的復合雜合變異,包括受體剪接位點變異c.681-1GA和移碼變異c.1582_1585del ATAT,p.Ile528*,分別遺傳自其父母;3.結合預測軟件及所在蛋白結構域的位置分析,兩個變異可能分別通過選擇性剪接跳躍形成異常剪接產物,以及編碼提前終止而形成截短蛋白來影響受體的功能,均可歸類為致病性變異;4.先證者切除性腺的組織病理學分析發(fā)現(xiàn)睪丸結構發(fā)育異常,符合LCH的診斷。結論:本部分研究報道了LHCGR基因上新發(fā)現(xiàn)的2個復合雜合變異,進一步拓寬基因型與表型的相關性,分析了受體不同功能結構域致病機理的差異。第三部分HFM1基因變異引起原發(fā)性卵巢功能不全致病機制的初步研究目的:原發(fā)性卵巢功能不全(Primary ovarian insufficiency,POI)是病因復雜的生殖系統(tǒng)疾病,減數(shù)分裂基因HFM1與POI發(fā)生相關,然而其致病機制尚不明確。本部分研究擬以在POI患者中鑒定的HFM1錯義變異為切入點,分析其可能的致病機理。方法:1.采用定點突變法在HFM1野生型質�；A上構建突變型表達載體,并將野生型和突變型HFM1質粒瞬時轉染入HEK 293T細胞;2.收集轉染細胞,提取總RNA,行逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測m RNA水平的表達情況,并進行統(tǒng)計學分析;3.提取轉染細胞的總蛋白,行蛋白免疫印跡實驗檢測蛋白水平的表達情況;4.根據蛋白序列結合SWISS-MODEL、Py MOL等軟件構建模擬的蛋白三維結構。結果:1.測序驗證7個突變型(c.148、c.1241、c.2206、c.2325、c.2651、c.3367及c.3580)表達質粒構建成功;2.HFM1突變型與野生型質粒在m RNA水平的表達量無統(tǒng)計學差異;3.HFM1突變型質粒在HFM1蛋白表達水平上與野生型質粒無明顯差異;4.基于蛋白結構模型,變異p.His414Pro、p.Phe775Leu和p.Ile884Ser位于HFM1蛋白的關鍵功能結構域,而p.Gly736Ser和p.Ser1123Pro則位于重要基序中。結論:1.本部分研究發(fā)現(xiàn)在人類POI疾病中已報道的HFM1基因錯義變異未影響體外HFM1蛋白的表達,這些變異并非通過降低蛋白表達而致病;2.根據變異所在蛋白質結構的位置、氨基酸理化性質的改變等,推測其致病機制可能是影響相關重要結構域和基序而引起酶功能異常,為下一步深入研究提供了線索。
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R440;R588
【圖文】：

圖 1. 胚胎期性發(fā)育示意圖（From Biason-LauberA, et al. “Ovarian development and disease: The known and theunexpected.”[10]）體在多種轉錄因子的作用н進 步發(fā)育為睪丸或卵巢（性腺性別），其中最關鍵的是 Y 染色體т性別決定基因 SRY，聯(lián)合 SOX9、NR5A1 等轉錄因子誘導原始性腺向睪丸分化[13-15]，而 X 染色體т NR0B1 基因則抑制這 過程，у WNT4 信號因子等共同促進向卵巢分化[16,17]；胚胎 7 周之后，固有的兩套原始生殖管道（中腎管和中腎旁管）在п同因子、激素作用н逐漸分化為男性或女性生殖器官。對于 46,XY 而言，睪丸 Sertoli 細胞分泌的抗苗勒管激素（anti-mullerianhormone,AMH）可激活 Smad 信號通路，刺激中腎旁管發(fā)生退化吸收，抑制其向輸卵管、子宮、陰道等女性內生殖器官分化[10,18-19]，而睪丸 Leydig 細胞產生的睪酮則刺激中腎管發(fā)育為附睪、輸精管、射精管等男性內生殖器結構[5,12]；另 方面，

圖 2. 性分化的分子機制示意圖A. 原始性腺分化為睪丸或卵巢；B. 男性性分化；C. 女性性分化（From Rey R, et al. “Sexual Differentiation”[12]）新 代測序技術（next-generation sequencing，NGS）也稱高通量測序技術憑借其能快速、高通量地檢測人類基因組中所有基因或目標區(qū)域基因的優(yōu)勢，極

2.4 88 例 DSD 患者及 POMES 數(shù)據的統(tǒng)計分析如圖 3A 所示，88 例先證者根據染色體核型分為 46,XYDSD（68/88，77.3%）和 46,XXDSD（20/88，22.7%）。就診時年齡<1 歲的嬰幼兒患者 14 例，其中 46,XY 13 例，46, XX 1 例；1~5 歲幼兒期患者 11 例，其中 46, XY 9 例，46, XX 2例；5~9 歲兒童期（青春期前）14 例，其中 46,XY13 例，46,XX1 例；9~14 歲即青春早期患者最多，30 例，46,XY24 例，46,XX6 例；大于 14 歲即青春后期患者 19 例，其中 46, XY 9 例，46, XX 10 例（見圖 3B）。

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 胥雨菲;王劍;;減數(shù)分裂基因致原發(fā)性卵巢功能不全的研究進展[J];中華醫(yī)學遺傳學雜志;2017年02期

本文編號：2797068