【摘要】：本研究以蛋白質(zhì)健康標(biāo)志物準(zhǔn)確定量為目的,將蛋白質(zhì)定量問題歸為總蛋白定量、無需考慮活性的特定靶標(biāo)蛋白定量及活性靶標(biāo)蛋白定量三類,分別提出解決方案,較為系統(tǒng)的形成了蛋白質(zhì)健康標(biāo)志物準(zhǔn)確定量方法體系。首先,針對由不同蛋白質(zhì)混合物作為健康標(biāo)志物的定量體系,以血清總蛋白測定為例,采用國際公認(rèn)參考方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟(IFCC)將雙縮脲法作為血清總蛋白濃度測定的參考方法,其本身具有操作簡單、抗干擾能力強、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。但即使在實驗參數(shù)以及實驗流程都被嚴(yán)格規(guī)定的情況下,不同實驗室得出的實驗數(shù)據(jù)仍然可能存在較大差異。因此,如何嚴(yán)格的執(zhí)行參考方法獲得準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果具有重要意義。本研究通過對參考方法中各參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)、建立計量溯源性來保證參考方法被準(zhǔn)確、嚴(yán)格的執(zhí)行。在實驗過程中,按照參考方法對各參數(shù)的要求,使用濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)130225、GBW(E)130226)逐一對實驗中使用的紫外-可見分光光度計波長、吸光度進(jìn)行校準(zhǔn),使用純水稱重法對移液器進(jìn)行校準(zhǔn);使用蛋白標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白(SRM927)作為血清總蛋白含量溯源依據(jù),以蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)牛血清白蛋白(BW3627-1)和凍干人血清白蛋白(GBW09187)作為樣品,對雙縮脲法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、再現(xiàn)性、檢出限、定量限等方法學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了評價,從而建立準(zhǔn)確可靠的血清總蛋白定量方法。并對國際參考實驗室室間質(zhì)量評價活動(RELA)的國際對比血清樣品A、B進(jìn)行了定量測定和不確定度評價。國際比對反饋的結(jié)果表明,我們的結(jié)果和其它實驗室具有很好的一致性,表明了測定方法的準(zhǔn)確以及測定技術(shù)的可靠性。其次,針對由無需考慮活性的單一蛋白健康標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量問題,以血清中人心脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)測定為例,采用同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。心肌脂肪酸結(jié)合蛋白作為心肌損傷標(biāo)志物的一種,對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量對于心血管疾病診斷治療具有重要意義。采用質(zhì)量平衡法和同位素稀釋質(zhì)譜法對心肌脂肪酸結(jié)合蛋白進(jìn)行了純品含量測定,測定結(jié)果分別為0.795 g/g和0.781 g/g,并對同位素稀釋質(zhì)譜方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、不確定度等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行了評價。最后,建立了血清中心肌脂肪酸結(jié)合蛋白的同位素稀釋質(zhì)譜測定方法,測定結(jié)果為2.56 ng/g,與ELISA試劑盒的測定結(jié)果2.34 ng/g具有良好的一致性,同時對該方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率、檢出限以及定量限進(jìn)行了評價。心肌脂肪酸結(jié)合蛋白純品同位素稀釋質(zhì)譜方法以及血清中心肌脂肪酸結(jié)合蛋白同位素稀釋質(zhì)譜方法都可以溯源到SI單位,可以作為心肌脂肪酸結(jié)合蛋白純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、血清中心肌脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測定方法,對于心肌脂肪酸結(jié)合蛋白的測定準(zhǔn)確性、互通性具有重要意義。最后,針對活性靶標(biāo)蛋白定量問題,以大豆轉(zhuǎn)基因G2蛋白為例,采用PCR蛋白定量方法進(jìn)行定量�，F(xiàn)今大部分蛋白質(zhì)的檢測方法都需要標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行相對定量,因而無法對活性靶標(biāo)蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的絕對定量。利用抗原抗體的特異性結(jié)合來捕捉活性靶標(biāo)蛋白質(zhì),再利用數(shù)字PCR儀作為測定儀器,就可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)活性靶標(biāo)蛋白濃度的絕對定量�；谝陨显O(shè)想,在熒光PCR以及數(shù)字PCR上進(jìn)行了蛋白質(zhì)的相對定量實驗以保證絕對定量方法的可行性。本文使用大豆轉(zhuǎn)基因G2蛋白以及G2蛋白的兩個不同結(jié)合位點的單抗mbA1、mbA2為基礎(chǔ),使用TaqMan(?)蛋白系列試劑盒成功地建立了熒光PCR G2蛋白定量方法以及數(shù)字PCR G2蛋白定量方法。并使用G2蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測樣品,對兩種方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、再現(xiàn)性、檢出限以及定量限進(jìn)行了評價。并把兩種方法的方法學(xué)參數(shù)和所建立的ELISA法的方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行了對比,結(jié)果表明PCR蛋白定量方法具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。同時,數(shù)字PCRG2蛋白定量方法由于其使用儀器為數(shù)字PCR,其結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性要比熒光PCR G2蛋白定量法的結(jié)果好。另外,由于數(shù)字PCR儀能直接給出樣品的拷貝數(shù)而不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,所以對數(shù)字PCR蛋白定量方法進(jìn)行了G2蛋白活性靶標(biāo)蛋白濃度的絕對定量探究。
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ937;R446.1
【圖文】：

用紫外－可見光分光光度計測定雙縮脲反應(yīng)前后溶液在波長５４０邋ｎｍ處的吸光度逡逑值。為了準(zhǔn)確的得到雙縮脲反應(yīng)前后的吸光度值變化，需要測定四個吸光度值并逡逑且用于之后樣品總蛋白濃度的計算。實驗原理如圖２－１所示，吸光度值Ａ１為堿逡逑性酒石酸的空白，測定的是堿性酒石酸在波長５４０邋ｎｍ處的吸光度值；吸光度值逡逑Ａ２為測定堿性酒石酸溶液加入與反應(yīng)組等量的血清樣品后在波長５４０邋ｎｍ處的逡逑吸光度值；則Ａ２－Ａ１為樣品空白。吸光度值Ａ３為試劑空白，測定的是雙縮脲試逡逑劑加入與反應(yīng)組等量的超純水后在波長５４０邋ｎｍ處的吸光度值；吸光度值Ａ４為逡逑１３逡逑

逑２．３．６結(jié)果反饋逡逑本次國際比對組織者反饋回來的結(jié)果如圖２－２所示，圖中０９２編號對應(yīng)著我逡逑們的實驗數(shù)據(jù)。我們的實驗數(shù)據(jù)可以和其它１７個實驗室數(shù)據(jù)中的１３個實驗室數(shù)逡逑據(jù)相互覆蓋，這也充分的表明了我的實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。逡逑Ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邐ＲＥＬＡ２０１５逡逑邐邋§邐２ｉ．ｏｅ．ｉ？逡逑Ｂ邋Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ＬａｂＣｏｄｅ邋９２邐邐逡逑＂６６邐ＬａｂＣｏｄｅ邐Ａ邐ｅ．ｏ．邐Ｂ邐ｅ．ｕ．邐ｒｒ＾ｗｘｌ逡逑？邐７，４７邐０．０９０邐５，９７邐０．０７０邐ｓｐｅｃｔｒｏｃｉｈＣＫ＞ｉｒｉｅｔｒｙ逡逑0邐７，１８７邐＜３，１３Ｓ邐Ｓ．９０２邐Ｏ．ｍ邐ｓｐｆｅＣＴＯｐｈａｔｏｍｇｔｒｙ邋ｒＯｏｕ＾ａｓ；逡逑ｆｅ邐７．５６３邐０，１４２邐５．９７邐０．ｉｔ２邐＾ａｆＯｐｎｏｉＱｉＰｅｔｆｙ邋（Ｄｍｍｓ；逡逑？邐７．Ｓ６邐０．】邐ｔ，０邐０，０９０邐＾ｉｅｃ８00ｆｔＷ0ｔｎｅｉｒ＞逡逑７，３８邋０Ｊ７邐５，８８邐０．Ｕ邐｛Ｄｏｕｍａｓ；逡逑■？６．２邐＿邐邐７．４７邐０．０？０邐＾９３８邐５．０４＾邋ｇｉｅｃｇＯｐｆｉＣＫ－ｉｎＷｙ邋ｉＤｏｕＴ．ａｓ；—逡逑７

括號中的數(shù)字表示含有的氨基酸殘基的個數(shù)。逡逑３．３．１．２凝膠電泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）純度測定結(jié)果逡逑如圖３－１，邋Ｈ－ＦＡＢＰ條帶位于１丨－１７邋ｋＤａ之間，通過Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｏｎｅ軟件計算該逡逑條帶分子量位１４邋ｋＤａ，與文獻(xiàn)報道和理論序列計算結(jié)果一致。除目標(biāo)條帶外，逡逑未見其它雜質(zhì)條帶，說明Ｈ－ＦＡＢＰ的蛋白純度達(dá)到要求。逡逑Ｓｔａｉｎｅｄ邋ｇｅｌ逡逑？ｍｍ邋，邋邐邐７２逡逑■＃邐邋ｇｇ逡逑知施痛—３６逡逑淲’邐邋２Ｂ逡逑物ｗ邋—邋邋１７逡逑＂＾＾＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊逡逑圖３－１邋Ｈ－ＦＡＢＰ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳純度測定結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ＳＤＳ－ＰＡＧＥ逡逑（左側(cè)泳道為Ｈ－ＦＡＢＰ樣品結(jié)果，右側(cè)泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果，右側(cè)的數(shù)字表示分子逡逑量標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的分子量值，單位為ｋＤａ）逡逑３．３．１．３邋ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量測定結(jié)果逡逑Ｈ－ＦＡＢＰＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ測定結(jié)果如圖３－２所示，在１５０００左右的峰為Ｈ－ＦＡＢＰ逡逑的單電荷的質(zhì)譜峰，７５００左右的的峰為Ｈ－ＦＡＢＰ雙電荷峰�？偣策M(jìn)行了邋６次測逡逑定

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 李佳樂;武利慶;金有訓(xùn);王晶;楊彬;楊屹;;人血清白蛋白純品含量的同位素稀釋質(zhì)譜方法研究[J];計量學(xué)報;2016年03期

2 李佳樂;武利慶;劉文麗;金有訓(xùn);陳鴻飛;楊彬;楊屹;;人轉(zhuǎn)鐵蛋白含量同位素稀釋質(zhì)譜測定方法研究[J];中國測試;2015年05期

3 周萬軍;徐湘民;;α和β地中海貧血無創(chuàng)產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展[J];國際生殖健康/計劃生育雜志;2014年03期

4 崔琳;李立奇;;結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)標(biāo)志物研究進(jìn)展[J];中國普通外科雜志;2014年04期

5 王念武;王婷;沈建國;胡方平;;基于鎖式探針的番茄潰瘍病菌實時熒光PCR快速檢測[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年05期

6 張書永;;免疫膠體金快速診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用與質(zhì)量控制[J];中國醫(yī)學(xué)裝備;2013年05期

7 周婷;劉池波;徐小輝;梁海燕;;帕金森病相關(guān)血清蛋白質(zhì)標(biāo)志物的篩選及鑒定[J];中國病理生理雜志;2013年04期

8 趙煥英;包金風(fēng);;實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2007年04期

9 伍永明;張祥林;羅明;;西瓜細(xì)菌性果斑病菌Taq Man探針實時熒光PCR檢測鑒定方法的建立[J];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2006年03期

本文編號：2795837