【摘要】：目的:Disabled-2(簡稱Dab2),是一種可負向調(diào)控Wnt信號通路的多功能銜接蛋白。先前研究發(fā)現(xiàn)Dab2在肺癌中表達下調(diào),并與肺癌的進展和不良預(yù)后正相關(guān),轉(zhuǎn)染Dab2可以明顯抑制肺癌細胞中Wnt通路的活性。DNA連接酶Ⅳ(簡稱LIG4),在大腸癌中作為Wnt通路靶基因,主要參與DNA損傷后非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)。因此,我們猜測Dab2是否可通過Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)LIG4的表達,進而抑制肺癌細胞的DNA雙鏈斷裂(DSB)后的損傷修復(fù)能力,從而增加肺癌細胞的放療敏感性。研究方法:免疫組織化學(xué)染色檢測了103例肺癌組織標本Dab2和LIG4的表達,并分析兩者表達的關(guān)系及其與臨床病理因素和患者預(yù)后的關(guān)系。構(gòu)建野生型Dab2及突變型Dab2質(zhì)粒(Dab2-PTB和Dab2-ΔPTB),并利用Dab2 siRNA,Wnt通路抑制劑iCRT-14和LIG4抑制劑SCR7,雙向調(diào)控Dab2的表達和Wnt通路的活性。通過Western Blot檢測Dab2,Wnt通路因子,LIG4及磷酸化γ-H2AX表達情況,用免疫熒光觀察磷酸化γ-H2AX焦點數(shù)以判斷X-ray照射后DNA的損傷修復(fù)情況,采用克隆形成實驗、基質(zhì)膠侵襲實驗判斷肺癌細胞照射后放療增敏的情況。結(jié)果:免疫組化表明Dab2低表達(及LIG4高表達)與肺癌的低分化、高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后呈正相關(guān)。Western Blot結(jié)果顯示經(jīng)X-ray照射后,過表達Dab2和Dab2-PTB下調(diào)Wnt通路關(guān)鍵分子β-catenin,下調(diào)下游靶基因cyclinD1,MMP-7及LIG4的表達(P0.05),促進磷酸化γ-H2AX表達上調(diào)(P0.05);而轉(zhuǎn)染Dab2-ΔPTB則上述因子沒有明顯變化。應(yīng)用siRNA敲除A549中Dab2的表達后,明顯上調(diào)了β-catenin、cyclinD1、MMP-7和LIG4的表達,而磷酸化γ-H2AX表達下調(diào)(P0.05),這種變化在聯(lián)合應(yīng)用iCRT-14被明顯逆轉(zhuǎn)(P0.05)。克隆形成實驗及Transwell侵襲實驗表明,在H1299細胞中轉(zhuǎn)染野生型Dab2和突變體Dab2-PTB,經(jīng)X-ray照射后克隆形成率明顯下調(diào),而轉(zhuǎn)染Dab2-ΔPTB則無明顯變化。經(jīng)siRNA和X-ray處理后的A549細胞,克隆形成率和細胞侵襲數(shù)下調(diào)不明顯,而聯(lián)合應(yīng)用iCRT14和SCR7后,均出現(xiàn)了明顯的下調(diào)(P0.05)。結(jié)論:Dab2的低表達(LIG4的高表達)與肺癌的進展和患者的不良預(yù)后正相關(guān);Dab2通過負向調(diào)控Wnt通路下調(diào)其靶基因LIG4的表達,抑制DNA損傷修復(fù)能力增敏肺癌放療,Dab2基因可能成為臨床增敏肺癌放療的潛在靶點。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R734.2;R730.55
【圖文】：

這是臨床工作中亟待解決的問題。眾所周知，Wnt 信號傳導(dǎo)通路是一些復(fù)雜生物進程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，如胚胎育、干細胞維持、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，甚至與腫瘤發(fā)生有關(guān)[7-9]。Wnt 作為腫瘤微環(huán)境的重要信使，主要通過經(jīng)典 Wnt 通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。與此同時，Wnt 路可以通過促進 DNA 損傷修復(fù)和抑制凋亡，增強腫瘤細胞對電離輻射的抵抗能[7]。根據(jù)相關(guān)報道，我們發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞的放射敏感性是通過解除 Wnt 信號調(diào)節(jié)而增強的，包括膠質(zhì)母細胞瘤[11]、結(jié)直腸癌[12,13]、乳腺癌[14]、鼻咽癌[15]、管癌[16]、肺癌[17]、肝癌[18]和頭頸部腫瘤[19]等。因此，抑制 Wnt 信號可能是靶向療的重要途徑之一。Disabled-2（以下簡稱 Dab2）是哺乳動物/果蠅缺失基因家族的一員[20]，是個多功能銜接蛋白,包括三個功能區(qū)（圖 1）：C 端脯氨酸結(jié)合區(qū)（PRD）、N 磷酸酪氨酸結(jié)合區(qū)（PTB）和磷酸作用區(qū)（PID）[21],參與 Wnt/β-catenin 通路等種信號傳導(dǎo)通路。我們前期的研究結(jié)果表明，Dab2 主要通過 PTB 結(jié)構(gòu)域與 Ax競爭性結(jié)合，促進β-catenin 的降解，抑制 Wnt 通路[22,23]。

結(jié)果顯示肺癌細胞系中 Dab2 的蛋白表達水平均低于 HBE 細胞（圖3A-B）,我們選取 H1299 和 A549 細胞系進行后續(xù)實驗，Western Blot 證實了pcDNA-HA-Dab2 或 Dab2-siRNA 的轉(zhuǎn)染效率（圖 3C，F(xiàn)）。X-ray 照射前后的MTT 實驗結(jié)果顯示，相較于非照射組，過表達 Dab2 的照射組可顯著抑制 H1299細胞的增殖（圖 3D-E），然而，敲除 Dab2 的表達后，肺癌細胞對 X-ray 照射卻

12圖 4 Dab2 通過經(jīng)典 Wnt 通路下調(diào) LIG4 表達A-B：在 H1299 細胞中轉(zhuǎn)染 Dab2-WT 及其剪切體質(zhì)粒（Dab2-ΔPTB、Dab2-PTB），WB檢測 Wnt 通路蛋白及其 LIG4 的表達及灰度值統(tǒng)計。C-D：H1299 中過表達 Dab2 并加入 Gsk-3β抑制劑 Tideglusib（25μM/ml）作用 24 小時后，逆轉(zhuǎn)了下調(diào)的趨勢。E-F：敲除 A549 中 Dab2的表達，WB檢測顯示，明顯上調(diào)了β-catenin及LIG4的表達，但加入 iCRT14抑制劑（50μM/ml）作用24 小時后抑制了 LIG4、cyclinD1、MMP7 的表達。*P<0.05,**P<0.01。

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