【摘要】：[研究背景和目的]膿毒癥(sepsis)是急危重癥領(lǐng)域常見(jiàn)的臨床綜合征,涉及全身性炎癥反應(yīng),臨床治療困難,死亡率居高不下。目前對(duì)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制、病理生理過(guò)程仍缺乏清晰的認(rèn)識(shí),且經(jīng)過(guò)諸多的努力和探索,仍未找到針對(duì)膿毒癥的特異性藥物或療法,鑒于人們對(duì)膿毒癥發(fā)病過(guò)程的困惑及其給臨床治療造成的巨大壓力,深入探索膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和治療的新方向有著非一般的迫切性和重要的現(xiàn)實(shí)意義。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome System,UPS)介導(dǎo)了真核細(xì)胞大部分蛋白質(zhì)的降解,具有調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞增生、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能,是目前研究免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制的新熱點(diǎn)。去泛素化酶USP14是細(xì)胞內(nèi)UPS的重要調(diào)節(jié)酶,參與泛素介導(dǎo)蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的過(guò)程,在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和衰老的研究中較為廣泛,但在炎癥反應(yīng)中的作用報(bào)告很少。本研究將闡述去泛素化酶USP14在膿毒癥炎癥反應(yīng)中的作用和分子機(jī)制,為膿毒癥的治療提供新的潛在性靶點(diǎn)。[研究方法]1.通過(guò)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)人類(lèi)急性單核白血病細(xì)胞THP-1和鼠來(lái)源的巨噬細(xì)胞RAW264.7,構(gòu)建膿毒癥體外細(xì)胞炎癥模型。2.給予不同濃度的LPS(0、100、250、500ng/ml)作用THP-1細(xì)胞12、24h,Western blot檢測(cè)LPS對(duì)細(xì)胞內(nèi)USP14的蛋白表達(dá)影響。3.采用不同方法阻斷細(xì)胞內(nèi)USP14的去泛素化作用(IU1抑制USP14的活性、siRNA干擾USP14的轉(zhuǎn)錄表達(dá)),進(jìn)而研究USP14在膿毒癥炎癥反應(yīng)中的作用和分子機(jī)制。4.建立THP-1炎癥細(xì)胞模型,采用USP14的特異性抑制劑IU1預(yù)處理THP-1細(xì)胞2h:MTS檢測(cè)細(xì)胞活力,Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎因子(TNF-α、IL-6)的釋放量,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)以及NF-κB P65核轉(zhuǎn)位變化,細(xì)胞免疫熒光共聚焦進(jìn)一步觀察NF-κB P65核轉(zhuǎn)位情況。5.建立THP-1炎癥細(xì)胞模型,采用脂質(zhì)體(Lipofectamine 3000)轉(zhuǎn)染USP14 siRNA48h對(duì)THP-1細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理:MTS檢測(cè)細(xì)胞活力,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清促炎因子(TNF-α、IL-6)的釋放量,Western blot檢測(cè)MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)以及NF-κB P65核轉(zhuǎn)位變化。6.建立RAW264.7炎癥細(xì)胞模型,采用USP14的特異性抑制劑IU1預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞2h:MTS檢測(cè)細(xì)胞活力,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中促炎因子(TNF-α、IL-6)的釋放量,qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表達(dá)水平,Western blot檢測(cè)MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)以及NF-κB P65核轉(zhuǎn)位變化。[研究結(jié)果]1.LPS刺激THP-1細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞后,ELISA結(jié)果表明,LPS組與對(duì)照組相比,細(xì)胞培養(yǎng)上清分泌的TNF-α和IL-6顯著升高,可成功構(gòu)建膿毒癥體外細(xì)胞炎癥模型。2.不同濃度(0、100、250、500ng/ml)LPS 作用 THP-1 細(xì)胞 12、24h,與對(duì)照組相比,LPS并不影響細(xì)胞內(nèi)USP14的蛋白表達(dá)。3.IU1在100μ 范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響,LPS聯(lián)合IU1處理細(xì)胞,與LPS組相比,細(xì)胞調(diào)亡情況無(wú)明顯差異。4.siRNA(40nM)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯差異,Western blot檢測(cè)USP14的蛋白表達(dá)明顯下調(diào),獲得較好的敲低效率。5.IU1抑制USP14的活性,在THP-1及RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中,qRT-PCR檢測(cè)促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表達(dá)水平明顯下降,與ELISA檢測(cè)所反映的抗炎效果一致,另外Western blot的結(jié)果顯示ERK1/2的磷酸化減少,但JNK、P38的磷酸化水平未見(jiàn)明顯改變,同時(shí),IκBα的磷酸化降解減少,使IκBα的表達(dá)增加,抑制了 NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。6.siRNA干擾USP14的轉(zhuǎn)錄表達(dá),在THP-1細(xì)胞炎癥模型中,能有效減少促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)的釋放量,同時(shí)減少了 ERK1/2和IκB的磷酸化,增加IκBα的表達(dá),抑制NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位。[結(jié)論]去泛素化酶USP14通過(guò)增加ERK1/2的磷酸化和NF-κB的活化調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7
【圖文】：

雙染后行流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估細(xì)胞凋亡情況。ＬＰＳ和不同濃度的ＩＵ１邋（２５，邋５０，邋７５逡逑和１００邋ＭＭ）共處理ＴＨＰ－１細(xì)胞，并沒(méi)有增加ＬＰＳ誘導(dǎo)ＴＨＰ－１細(xì)胞Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ逡逑和ＰＩ的染色，即ＩＵ１抑制ＵＳＰ１４的活性后不影響ＴＨＰ－１細(xì)胞凋亡（

反應(yīng)影響的分子機(jī)制，我們研究了邋ＵＳＰ１４是否可以調(diào)節(jié)ＭＡＰＫ活化。首先，逡逑我們發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的ＬＰＳ作用ＴＨＰ－１細(xì)胞，ＵＳＰ１４的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有改逡逑變（圖３Ａ）。而正如我們所假設(shè)的，抑制ＵＳＰ１４的活性顯著降低了邋ＬＰＳ誘導(dǎo)逡逑的ＥＲＫ１／２的磷酸化，但對(duì)ＴＨＰ－１細(xì)胞中ＪＮＫ１／２和ｐ３８邋ＭＡＰＫ的磷酸化沒(méi)有逡逑影響（圖３Ｂ）。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)ＵＳＰ１４ｓｉＲＮＡ沉默ＵＳＰ１４，邋ＵＳＰ１４的蛋逡逑白表達(dá)明顯下調(diào)，即明顯敲低了邋ＵＳＰ１４Ｃ圖３Ｃ，邋Ｄ），而敲低ＵＳＰ１４同樣顯著逡逑降低ＴＨＰ－１細(xì)胞中ＬＰＳ誘導(dǎo)的ＥＲＫ１／２磷酸化（圖３Ｅ）。上述結(jié)果表明：在逡逑ＴＨＰ－１細(xì)胞中，抑制ＵＳＰ１４的活性或者敲低ＵＳＰ１４阻斷其去泛素作用，可以逡逑減少ＬＰＳ誘導(dǎo)的ＥＲＫ１／２的磷酸化。逡逑Ａ逡逑１２ｈｏｕｒ邐２４ｈｏｕｒ逡逑０邐１００邋２５０邋５００邋０邐１００邋２５０邋５００邋ＬＰＳ（ｎｇ／ｍＬ）逡逑？參S�？�

本文編號(hào)：2786496