【摘要】：作為一種常見的呼吸道傳染病病原,甲型流感病毒會造成急性上呼吸道感染,可通過空氣飛沫等途徑迅速傳播,一直以來嚴(yán)重威脅人類生命健康。因此,建立通用性甲型流感病毒的快速檢測技術(shù)在甲型流感患者的早期篩查和診療方面具有重要意義,可為及時有效應(yīng)對此類傳染病疫情的爆發(fā)提供技術(shù)支持。目的:本課題立足于呼吸道傳染病疫情頻發(fā)嚴(yán)的現(xiàn)實背景,擬設(shè)計一種簡便、易用、便攜的管式呼(咳)出氣收集裝置,以滿足上呼吸道傳染病病原樣本的快速收集目的。同時,利用納米材料及等溫擴增技術(shù)在傳染病檢測方面的優(yōu)勢,建立一種簡便、準(zhǔn)確、靈敏的甲型流感病毒檢測方法,以解決現(xiàn)有檢測方法中存在的采樣操作復(fù)雜、樣本背景干擾大、操作步驟冗繁,以及依賴大型儀器不利于實施現(xiàn)場檢測的問題。方法:對目前已有的關(guān)于呼(咳)出氣采集裝置的相關(guān)報道、文獻、專利及商品化產(chǎn)品進行調(diào)研。以上呼吸道傳染病病原體采集為目標(biāo),基于氣溶膠相變原理和受限空間流體運動規(guī)律,設(shè)計了一種管式呼(咳)出氣采集裝置。設(shè)計并構(gòu)造該裝置實物,并針對該裝置分別對儀器降溫速率、采集管降溫速率、冷凝液收集量三個內(nèi)容進行測定,以評價其工作效能。以甲型流感M1蛋白的特點序列設(shè)計HCR反應(yīng)引物序列,并通過瓊脂糖凝膠電泳實驗對反應(yīng)結(jié)果進行驗證。隨后,分別固定FAM基團修飾的H1、H2濃度、Itarget濃度優(yōu)化氧化石墨烯(GO)的淬滅作用濃度和時間。接著以優(yōu)化好的GO淬滅作用濃度和時間對HCR反應(yīng)進行反應(yīng)時間優(yōu)化,確定最終的反應(yīng)條件。最后依據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)檢測條件,分別從單堿基錯配識別能力、定量檢測能力、甲型流感通用性檢測能力及臨床樣本檢測四個方面對該檢測方法進行評估。結(jié)果:建立了氣溶膠快速冷凝的呼(咳)出氣采集裝置,主要性能為:儀器制冷模塊能夠在開機10分鐘內(nèi)從28℃降溫到-4℃內(nèi),具有降溫速度快,溫度工作穩(wěn)定的特點;采集管溫度在1分鐘之內(nèi)可由室溫迅速降到2℃,具有良好的制冷效果;1分鐘內(nèi)的采集樣本量可達200μL左右,滿足后續(xù)檢測用量。建立了基于HCR反應(yīng)和GO淬滅熒光的甲型流感病毒檢測方法,優(yōu)化確定的HCR反應(yīng)條件為:H1,H2各50nM,反應(yīng)時長為2.5h,反應(yīng)結(jié)束后以20μg/mL的GO對反應(yīng)產(chǎn)物進行淬滅,熒光淬滅時長為30min;淬滅結(jié)束后檢測熒光強度,激發(fā)波長480nm,發(fā)射波長520nm。實驗結(jié)果表明,所建立的HCR檢測方法能夠特異甲型流感病毒(H1、H5、H7型),與乙型流感病毒、腺病毒的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),I_(target)組熒光強度高于I_(mismatch)組(P0.05)表明該方法具有單堿基錯配識別能力,該方法陽性檢測范圍為5-100nM,同時在10-40nM范圍內(nèi)熒光強度與目標(biāo)檢測物濃度表現(xiàn)出了良好的線性關(guān)系(y=4.7576x-10.401 R2=0.9858)。對15例鼻咽拭子的檢測結(jié)果表明,所建立的HCR檢測方法與Real time-PCR檢測結(jié)果完全一致。結(jié)論:本研究研發(fā)了一種針對于上呼吸道傳染病樣本的管式呼(咳)出氣采集裝置,具有降溫效率高、目標(biāo)溫度可控、小巧便攜、易于操作等特點,可滿足上呼吸道傳染病樣本快速采集需求,并為后續(xù)與生物傳感檢測設(shè)備的聯(lián)用奠定了基礎(chǔ)。此外,基于雜交鏈?zhǔn)?HCR)反應(yīng),利用氧化石墨烯對熒光基團的淬滅作用設(shè)計了一種通用型甲型流感病毒的快速檢測方法。這種HCR擴增檢測技術(shù)具備等溫、無酶、反應(yīng)體系簡單、操作步驟簡便等優(yōu)點,表現(xiàn)出較好的樣本檢測能力,具有良好的現(xiàn)場檢測應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R511.7;R440
【圖文】：

管式呼（咳）出氣收集裝置主視圖

管式呼（咳）出氣收集裝置左視圖

圖 1-3 管式呼（咳）出氣收集裝置俯視圖模塊：模塊由制冷金屬體（320），熱防護層（321），制冷半），制冷控制電路（350），制冷風(fēng)扇（300），制冷溫度指示（331），8 個部分組成。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉金釧;呂珍珍;陳愛亮;;適配體納米金比色分析技術(shù)研究進展[J];光譜學(xué)與光譜分析;2014年08期

本文編號：2780389