【摘要】：目的:白細(xì)胞分類檢測是臨床檢驗(yàn)的重要指標(biāo),是疾病診斷的重要依據(jù)。目前實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院大多使用全自動(dòng)血液分析儀,這種設(shè)備具有計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性高、一次性可檢測樣本量大、檢測指標(biāo)多等優(yōu)點(diǎn),對于醫(yī)院有大量病人和實(shí)驗(yàn)室里有大量樣本需要檢測的場合非常適用。但是此類設(shè)備在戰(zhàn)現(xiàn)場救援、抗震救災(zāi)、基層診療及其它多種復(fù)雜環(huán)境下的應(yīng)用上也具有很多局限性:(1)設(shè)備體大質(zhì)重,導(dǎo)致攜行性差;(2)設(shè)備內(nèi)部結(jié)構(gòu)精密復(fù)雜,抗振動(dòng)能力差;(3)因?yàn)樵O(shè)備采用濕化學(xué)技術(shù)原理,需多種液體試劑耗材配套才能完成檢驗(yàn)工作,試劑不便于儲(chǔ)存并且液體試劑在低溫環(huán)境下容易受凍失效;(4)所用配套耗材一般為上百人份用量,拆封后短期必須用完,否則將過期失效,不適用于患者量不多的環(huán)境下的血常規(guī)檢測;(5)設(shè)備價(jià)格昂貴并且維護(hù)費(fèi)用高,不適用于基層或邊遠(yuǎn)艱苦地區(qū)使用。針對上述問題,本課題研究一種適用于POCT設(shè)備的白細(xì)胞分類檢測系統(tǒng),該系統(tǒng)具備操作簡單、環(huán)境適應(yīng)性好、無需專門維護(hù)和可快速輸出檢測結(jié)果等優(yōu)勢,既可用于醫(yī)院床旁樣本快速檢測、基層醫(yī)療常規(guī)臨床化驗(yàn),也可用于戰(zhàn)場或?yàn)?zāi)害現(xiàn)場等醫(yī)療衛(wèi)生體系不完善,并且有大量傷病員需快速診斷的場合,可彌補(bǔ)傳統(tǒng)血細(xì)胞分析儀的不足,為進(jìn)一步研制成POCT白細(xì)胞分類設(shè)備提供技術(shù)支撐。研究內(nèi)容與研究方法:通過詳細(xì)分析課題所研制系統(tǒng)的主要功能與應(yīng)用定位,針對新鮮人體血樣這一檢測目標(biāo),綜合運(yùn)用微流控芯片技術(shù)、多模成像光學(xué)檢測技術(shù)以及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法,完成了白細(xì)胞自動(dòng)分類檢測系統(tǒng)的創(chuàng)建,然后以傳統(tǒng)血液分析儀為對照,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)評價(jià)本系統(tǒng)對白細(xì)胞分類檢測的準(zhǔn)確度、精密度等關(guān)鍵指標(biāo)。具體研究內(nèi)容包括以下四個(gè)方面:1、血液樣品處理和微流控芯片設(shè)計(jì)。首先需要對血液進(jìn)行溶血和染色處理,溶血的目的是去除血液中紅細(xì)胞對白細(xì)胞計(jì)數(shù)的干擾,并且不破壞白細(xì)胞整體結(jié)構(gòu),染色的目的是為了實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞的成像檢測功能,另外還需考慮血液與試劑反應(yīng)時(shí)間不宜過長且效果穩(wěn)定等因素,以確保系統(tǒng)對白細(xì)胞的檢測快速、準(zhǔn)確。其次對微流控芯片中微腔的設(shè)計(jì)需要考慮樣本在不同光源照射下,白細(xì)胞的成像效果,微腔過厚會(huì)導(dǎo)致圖像內(nèi)細(xì)胞粘連嚴(yán)重,微腔過薄,則需增加檢測視野面積,否則檢測視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)量過少會(huì)導(dǎo)致喪失統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此必須對微腔厚度及面積大小進(jìn)行分析與論證,以滿足成像和統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求。2、光學(xué)成像系統(tǒng)設(shè)計(jì)。針對樣本特性設(shè)計(jì)了多模態(tài)光路成像光學(xué)系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)單粒子的側(cè)向散射光、前向散射光和熒光成像功能,省去傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)中的精細(xì)的液路結(jié)構(gòu)、高靈敏度的檢測器和復(fù)雜的光電檢測系統(tǒng)。重點(diǎn)介紹了成像光路結(jié)構(gòu)以及光源波長選擇,設(shè)計(jì)微球模擬實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證前向散射光的均勻性和對不同尺寸的微小細(xì)胞區(qū)分的可行性。3、白細(xì)胞分類檢測圖像處理算法。首先細(xì)胞圖像分割以熒光圖像為主要處理對象,使用邊界跟蹤算法提取細(xì)胞邊界信息,對特殊的粘連細(xì)胞利用邊界剝離算法將其分開,利用細(xì)胞位置信息定位并提取,前向散射圖像和側(cè)向散射圖像中相應(yīng)的細(xì)胞信息。其次是建立有效數(shù)據(jù)集,并利用該數(shù)據(jù)構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了訓(xùn)練與測試。4、系統(tǒng)性能評價(jià)研究。以Sysmex XE-5000血液分析儀為參照,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),對白細(xì)胞分類系統(tǒng)的準(zhǔn)確度、精密度等進(jìn)行評價(jià)。本系統(tǒng)針對以上四個(gè)方面的研究,針對新鮮人體血液白細(xì)胞分類這一特定檢測項(xiàng)目,提出一種基于微流控技術(shù)和多模態(tài)光學(xué)成像技術(shù)的白細(xì)胞分類檢測系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵技術(shù)突破,可為戰(zhàn)場急救、災(zāi)害救援及基層醫(yī)療中的白細(xì)胞快速分類檢測提供支持。結(jié)果:(1)在血液預(yù)處理操作中,將新鮮血液稀釋三倍,取100μl,加入10μl NP-40和10μl吖啶橙,可得到最佳血液預(yù)處理效果。同時(shí)經(jīng)計(jì)算模擬,微流控芯片的微腔厚度確定為100μm,面積為2mm×2mm,可較好的滿足白細(xì)胞成像檢測條件。(2)考慮吖啶橙熒光染色特性,熒光光源選擇中心波長λ為480nm的激發(fā)光源;同時(shí)為了減少血液中血紅蛋白對樣本透光率的影響,最終散射光光源選擇中心波長λ為650nm的激發(fā)光源。在FSC光路中,遮光片與透鏡組合可有效阻止前向散射光光源進(jìn)入到相機(jī)中,并且可以透過90%以上的細(xì)胞散射光。側(cè)向散射光和熒光光源因?yàn)槌室欢ń嵌日丈錁颖?不會(huì)直接進(jìn)入到相機(jī)中,在熒光光路中采用下方照明的方式,降低因?yàn)檠t蛋白透光率引起的對白細(xì)胞的成像影響。(3)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練測試結(jié)果里,除單核細(xì)胞以外,淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的訓(xùn)練集和測試集準(zhǔn)確率均在90%以上,高于同類模式識別算法。但是對于單核細(xì)胞的處理,在成像方式、特征值提取等方面仍然需要進(jìn)一步改善。(4)系統(tǒng)對白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)中,利用Passing-Bablok回歸模型分析,選取100例樣本進(jìn)行檢測,實(shí)際測試表明,該系統(tǒng)與Sysmex XE-5000結(jié)果的比例差異為0.989,P0.05,二者檢測結(jié)果具有一致性。WBC濃度3.0×10~9/L的重復(fù)性測試結(jié)果中,變異系數(shù)小于4.0%,優(yōu)于同類型微流控細(xì)胞計(jì)數(shù)產(chǎn)品。系統(tǒng)線性評價(jià)實(shí)驗(yàn)中,得到檢測結(jié)果與理論值線性擬合R~2=0.9996,偏差范圍在±5%以內(nèi),證明系統(tǒng)線性檢測結(jié)果可靠。白細(xì)胞四分類計(jì)數(shù)評價(jià)實(shí)驗(yàn)中,共選取40例血樣進(jìn)行系統(tǒng)分類檢測,與Sysmex XE-5000設(shè)備檢測結(jié)果進(jìn)對比得出,淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的比例差異值都非常接近1(分別為0.949,0.953,1.077),系統(tǒng)差異值結(jié)果都非常接近0(分別為-0.312,0.648,0.002),P值均0.05,即為本系統(tǒng)測得的白細(xì)胞分類結(jié)果與Sysmex XE-5000設(shè)備的檢測結(jié)果具有一致性;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中測試結(jié)果顯示,嗜酸性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞變異系數(shù)略大,嗜酸性粒細(xì)胞主要是因?yàn)樵诎准?xì)胞內(nèi)占比很小,輕微的計(jì)數(shù)差異便可引起較大的變異系數(shù),單核細(xì)胞則是因?yàn)槠涮卣髦敌畔⑴c其它細(xì)胞特征值信息差別不明顯,其他兩類細(xì)胞變異系數(shù)結(jié)果較好,均小于6.5%。結(jié)論:課題研究成果為床旁檢測、基層或邊遠(yuǎn)地區(qū)、戰(zhàn)場及自然災(zāi)害現(xiàn)場的白細(xì)胞快速檢測分類、準(zhǔn)確分析結(jié)果提供了有效的方法,實(shí)現(xiàn)了白細(xì)胞檢測專用平臺(tái)的關(guān)鍵技術(shù)突破,提出了白細(xì)胞分類檢測系統(tǒng)性能評價(jià)方法,拓展了微流控芯片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,為POCT白細(xì)胞分類檢測設(shè)備的研制提供了方法與實(shí)踐參考。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.3;R446.1
【圖文】：

1.1 不同環(huán)境的作業(yè)條件（a）地震后應(yīng)急救援環(huán)境（b）高寒地區(qū)（c）艦船潛艇內(nèi)作業(yè)間（d）空間站II 國家層面：（1）重大事件現(xiàn)場應(yīng)急醫(yī)學(xué)救援的需求。近年來重大自然災(zāi)害大安全事故、公共衛(wèi)生事件時(shí)有發(fā)生，如圖 1.2（a）和 1.2（b）所示，應(yīng)急情況下的白細(xì)胞分類檢驗(yàn)設(shè)備可為救援工作者準(zhǔn)確判斷傷員病情和體征提供的診斷依據(jù)。同時(shí)，現(xiàn)場快速檢驗(yàn)對于醫(yī)療設(shè)備的抗震性、多地形適應(yīng)性、性、易操作性和快速準(zhǔn)確性具有較高要求，目前醫(yī)院使用的全自動(dòng)血液分析

很大程度上依賴于基層衛(wèi)生醫(yī)療保障，建設(shè)農(nóng)村、鄉(xiāng)鎮(zhèn)居民公共衛(wèi)生服務(wù)體，城市社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，深入推進(jìn)公立醫(yī)院轉(zhuǎn)型是今后國內(nèi)醫(yī)療改革的主要目，社區(qū)醫(yī)院是其中建設(shè)的重要一環(huán)，如圖 1.2（c）和 1.2（d）所示。目前醫(yī)院泛使用的血液分析儀大多采用濕化學(xué)技術(shù)原理，造價(jià)昂貴，操作復(fù)雜，內(nèi)部結(jié)精密且液路管道需經(jīng)常清洗維護(hù)，設(shè)備配套液體耗材一般為上百人份用量，拆后短期必須用完，否則將過期失效，不適用于基層醫(yī)療中患者量不大的情況。OCT 設(shè)備的簡單易操作性、價(jià)格低廉及檢測快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)充分滿足了基層醫(yī)療設(shè)的需求，適合在基層醫(yī)療衛(wèi)生服務(wù)中大力推行[25 27]。（3）我國醫(yī)療器械發(fā)展的需求。與歐美先進(jìn)發(fā)達(dá)國家相比，我國醫(yī)療器械的展還處于落后的狀態(tài)，醫(yī)療器械與藥品消費(fèi)比例遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家，而醫(yī)療器械整個(gè)醫(yī)療體系中又占有非常重要的位置，他決定著醫(yī)生對病人病情的診斷、治方案的確定及后續(xù)用藥，因此我國醫(yī)療設(shè)備的發(fā)展空間還很大[28 30]。其次，隨科技的發(fā)展和人們醫(yī)療保健需求的日漸提升，POCT 設(shè)備作為一種相對較新的醫(yī)器械，以其價(jià)格低廉、小型化、傻瓜式自動(dòng)檢測等優(yōu)勢，在未來將會(huì)成為日�；钪械囊徊糠�，成為遠(yuǎn)程診療服務(wù)、家庭健康管理的重要一環(huán)。

圖 1.3 離心后毛細(xì)管血樣分層放大視圖 圖 1.4 QBC AutoRead PluseCue 公 司 在 2008 年 生 產(chǎn) 了 第 一 款 可 實(shí) 現(xiàn) 白 細(xì) 胞 計(jì) 數(shù) 功 WBC System，并在該產(chǎn)品上市兩年之后，通過改進(jìn)圖像成像原理可實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞分類的檢測設(shè)備 HemoCue WBC DIFF System。該設(shè)的主機(jī)和一次性的微流芯片組成，如圖 1.5 所示，主機(jī)中包含微型顯和 LCD 顯示單元三部分。一次性芯片頂端微腔厚 120μm，可通過毛 10μl 血樣，迅速與微腔內(nèi)的干性溶血?jiǎng)┖腿旧噭┰噭┚鶆蚧旌�，到分析儀中可獲取微腔中細(xì)胞圖像，利用圖像算法處理實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞

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8 黃煒敏;多通道微流控芯片電泳電源的設(shè)計(jì)[D];長沙理工大學(xué);2018年

9 張鵬程;用于紙基微流控芯片制造的石蠟電噴規(guī)律實(shí)驗(yàn)研究[D];廈門大學(xué);2018年

10 王樂樂;微流控芯片的制備及與光纖傳感器集成的研究[D];深圳大學(xué);2017年

本文編號：2780037