【摘要】：目的:血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是參與腫瘤演進的重要因子,在多種腫瘤細胞中均有表達。本實驗旨在構(gòu)建99mTc標記靶向VCAM-1單鏈抗體(scFv)的分子探針,探討及評估其在不同腫瘤模型中特異性結(jié)合的能力以及靶向顯像的可行性。方法:通過使用6-肼基煙酸琥珀酰亞胺酯鹽酸鹽(SHNH),將靶向VCAM-1 的 scFv(VCAM-1scFv)與 99mTc 連接進行標記。VCAM-1 的表達水平可通過不同細胞系(黑色素瘤細胞B16F10及A375m、纖維肉瘤細胞HT1080、卵巢癌細胞SKOV3.ip、乳腺癌細胞MDA-MB-231及腎癌細胞786-0)的免疫熒光染色進行驗證。細胞攝取實驗、體內(nèi)單光子發(fā)射計算機斷層(SPECT)顯像和生物分布實驗分別用以測定99mTc-6-肼基煙酰胺(HYNIC)-VCAM-1seFv在體內(nèi)外與VCAM-1的結(jié)合能力。與此同時驗證腫瘤組織中VCAM-1的表達。結(jié)果:99mTc-HYNIC-VCAM-1seFv 的標記率為 81.46±3.61%(n=5),純化后的放射化學純度為96.54±1.65%(n=5)。體外攝取實驗表明,B16F10和HT1080細胞結(jié)合探針能力較強,4小時細胞攝取率分別為6.07±0.55%、5.73±0.41%(n=3),且不同腫瘤細胞對探針攝取能力與免疫熒光的VCAM-1表達水平較為一致。體內(nèi)SPECT成像及生物分布表明,B16F10和HT1080 腫瘤攝取較高(4.93±0.52%ID/g,4.65±0.39%ID/g,4h),SKOV3.ip腫瘤呈中等攝取(2.99士0.44%ID/g,4h),A375m、MDA-MB-231 和 786-0 腫瘤組織攝取較低(1.33士0.22%ID/g、1.49±0.23%ID/g 及1.47±0.31%ID/g,4h)。B16F10腫瘤與其阻斷組腫瘤1h攝取量分別為5.51±0.37%ID/g、2.92±0.26%ID/g(p0.001),表明 B16F10 腫瘤組織對99mTc-HYNIC-VCAM-1seFv高攝取可被過量的VCAM-1seFv抑制。與此同時,腫瘤組織熒光表達強度與腫瘤組織攝取有一定的相關(guān)性(R2=0.875,p0.001)。結(jié)論:99mTc-HYNIC-VCAM-1scFv能夠在體內(nèi)外檢測VCAM-1的表達水平,為體內(nèi)非侵入地評估VCAM-1的表達提供了新的手段。目的:血管細胞粘附分子-1(VascularCellAdhesionMolecule1,VCAM-1)在腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用,逐漸成為腫瘤監(jiān)測和治療的新靶點。LY2409881是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的IκB激酶β的抑制劑,可以誘導VCAM-1陽性表達的腫瘤細胞凋亡。本研究旨在評估68Ga標記的VCAM-1單鏈抗體(scFv)檢測VCAM-1陽性腫瘤表達的能力,并探討其監(jiān)測LY2409881對VCAM-1陽性腫瘤治療反應的可行性。方法:應用黑色素瘤細胞系B16F10和A375m分別制作VCAM-1過表達和低表達腫瘤模型。以1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)為放射性標記螯合劑,將VCAM-1 scFv與68Ga進行連接,構(gòu)建新型示蹤劑68Ga-NOTA-VCAM-1scFv。構(gòu)建B16F10和A375m荷瘤鼠模型,尾靜脈注射68Ga-NOTA-VCAM-1seFv后,分別進行microPET/CT成像、生物分布及放射自顯影研究,用以探究該分子影像探針在腫瘤模型中的分布和靶向能力。以IKKs抑制劑LY2409881為靶向治療藥物,在體外B16F10細胞中評估其細胞毒性。體內(nèi)實驗中,B16F10荷瘤小鼠腹腔內(nèi)注射LY2409881(每周兩次,100mg/kg),對照組采用等體積的溶劑對照DMSO進行腹腔注射。每隔一天測量小鼠體重及腫瘤體積,同時取5只小鼠每周尾靜脈注射68Ga-NOTA-VCAM-1scFv進行microPET/CT成像,動態(tài)監(jiān)測評估治療療效。結(jié)果:68Ga-NOTA-VCAM-1seFv的標記率為95.00±1.34%(n=5),純化后的放射化學純度為97.80±1.65%(n=5)。microPET/CT顯像、生物分布及放射自顯影實驗表明,68Ga-NOTA-VCAM-1seFv對表達VCAM-1p陽性的B16F10腫瘤親和力較高(3hB16F10和A375m腫瘤攝取分別為5.17±0.68%ID/g、1.87±0.55%ID/g)。隨著LY2409881濃度增加及作用時間延長,B16F10細胞活性逐漸降低,半數(shù)抑制濃度為17.69μM。體內(nèi)動物模型實驗也顯示出該抑制劑對B16F10腫瘤生長具有明顯的抑制作用(三周時治療組腫瘤抑制率為51.76%)。在治療監(jiān)測過程中,microPET/CT顯像及生物分布實驗表明LY2409881治療組在治療后第一周腫瘤組織對68Ga-NOTA-VCAM-1seFv攝取減少(從5.02士0.25%ID/g降低至3.68±0.27%ID/g),第二周回到治療前攝取水平。而在DMSO對照組中,腫瘤對68Ga-NOTA-VCAM-1seFv攝取保持相對穩(wěn)定水平。結(jié)論:LY2409881作為IKK2抑制劑,可以有效地抑制VCAM-1表達及腫瘤生長。68Ga-NOTA-VCAM-1seFv作為顯示VCAM-1表達的一種新型分子影像探針,制備簡便、標記率高、穩(wěn)定性好,圖像清晰。68Ga-NOTA-VCAM-1scFv的PET顯像可以用于VCAM-1陽性腫瘤分子表達的可視化探究,是監(jiān)測惡性腫瘤LY2409881治療效果的有效手段,具有良好的臨床應用前景。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730.44
【圖文】：

比活度為邋１６．２３±１．１３ＭＢｑ／ｎｍｏｌ邋（？＝５）。純化后，９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－逡逑ＶＣＡＭ－ｌｓｃＦｖ的放射化學純度為９６．５４士１．６５％，在ＦＢＳ和ＰＢＳ中１、３、６逡逑和１２小時后放射化學純度均超過９０％邋（圖１－１），具有良好的體外穩(wěn)定逡逑性。逡逑灥１１１逡逑＾邋，逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖１－１．邋９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－ＶＣＡＭ－ｌｓｄＶ？ＦＢＳ和ＰＢＳ中不同時間點的穩(wěn)定性。所逡逑有數(shù)據(jù)均表示為均值±ＳＤ邋（？＝５）。逡逑３．２體外ＶＣＡＭ－１表達逡逑通過免疫熒光染色評估６種腫瘤細胞系中ＶＣＡＭ－１表達水平（圖１－逡逑２）。其中Ｂ１６Ｆ１０、ＨＴ１０８０細胞熒光強度較強，ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞呈中等熒逡逑光強度，Ａ３７５ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和７８６－０細胞熒光強度較低。逡逑１６逡逑

比活度為邋１６．２３±１．１３ＭＢｑ／ｎｍｏｌ邋（？＝５）。純化后，９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－逡逑ＶＣＡＭ－ｌｓｃＦｖ的放射化學純度為９６．５４士１．６５％，在ＦＢＳ和ＰＢＳ中１、３、６逡逑和１２小時后放射化學純度均超過９０％邋（圖１－１），具有良好的體外穩(wěn)定逡逑性。逡逑灥１１１逡逑＾邋，逡逑Ｔｉｍｅ逡逑圖１－１．邋９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－ＶＣＡＭ－ｌｓｄＶ？ＦＢＳ和ＰＢＳ中不同時間點的穩(wěn)定性。所逡逑有數(shù)據(jù)均表示為均值±ＳＤ邋（？＝５）。逡逑３．２體外ＶＣＡＭ－１表達逡逑通過免疫熒光染色評估６種腫瘤細胞系中ＶＣＡＭ－１表達水平（圖１－逡逑２）。其中Ｂ１６Ｆ１０、ＨＴ１０８０細胞熒光強度較強，ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞呈中等熒逡逑光強度，Ａ３７５ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和７８６－０細胞熒光強度較低。逡逑１６逡逑

荷瘤鼠尾靜脈注射１、２、４小時進行顯逡逑像，均可以清楚地看到Ｂ１６Ｆ１０和ＨＴ１０８０腫瘤顯影，具有較好的腫瘤與逡逑背景對比（圖１－４Ａ和１－４Ｂ）。同時，在ＳＫ０Ｖ３．ｉｐ腫瘤中可觀察到腫瘤逡逑有明顯的放射性濃聚（圖１－４Ｃ），Ａ３７５ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１和７８６－０腫瘤逡逑組織顯像劑攝�。▓D１－４Ｄ、１－４Ｅ和１－４Ｆ）則較弱。如圖１－５所示，Ｂ１６Ｆ１０逡逑腫瘤阻斷顯像時腫瘤組織顯影不清，表明９９ｍＴｃ－ＨＹＮＩＣ－ＶＣＡＭ－ｌｓｅＦｖ可以逡逑特異性靶向ＶＣＡＭ－１陽性腫瘤。此外，腎臟和肝臟的圖像清晰可見，說逡逑明探針在體內(nèi)清除主要通過腎臟和肝臟途徑。逡逑１８逡逑

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本文編號：2778258