【摘要】：目的:探討丙肝非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B在上皮細(xì)胞間質(zhì)改變中所起的作用,以及其分子機制。方法:1.用高保真Taq酶從含有全長1b型HCV質(zhì)粒中擴增出NS4B片段,運用Eco RI和Bam HI雙酶切法構(gòu)建重組的PEGFPC1-NS4B質(zhì)粒,q RT-PCR、Westernblot、細(xì)胞免疫熒光方法檢測質(zhì)粒是否可在真核細(xì)胞表達丙肝NS4B蛋白;2.用陽離子脂質(zhì)體將空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HepG_2細(xì)胞中進行表達,或在HepG_2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,1μg,3μg,5μg重組質(zhì)粒,48h后,q RT-PCR、Western blot來檢測E-cadhrin、N-cadherin基因和蛋白表達變化,以觀察HepG_2細(xì)胞是否發(fā)生上皮細(xì)胞間質(zhì)改變;3.與2中相同的方法檢測HepG_2細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Snail基因和蛋白變化,并且通過sh RNA沉默snail的表達以觀察snail在丙肝NS4B導(dǎo)致的上皮細(xì)胞間質(zhì)改變中所起的作用;4.用細(xì)胞劃痕實驗觀察轉(zhuǎn)染了丙肝NS4B重組質(zhì)粒及共轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和Snail sh RNA的HepG_2細(xì)胞遷徙能力的改變;5.Westernblot檢測Scribble-Hippo-PI3K/AKT信號通路變化,以探究丙肝NS4B蛋白引起上皮細(xì)胞間質(zhì)改變分子機制。結(jié)果:1.測序及雙酶切鑒定結(jié)果顯示讀碼框和插入方向完全正確,并且在兩端成功插入了起始密碼子和終止密碼子,雙酶切片段結(jié)果為4725bp和796bp長度兩個片段,鑒定結(jié)果顯示目的基因已經(jīng)插入PEGFPC1空質(zhì)粒中,重組PEGFPC1-NS4B質(zhì)粒可在HepG_2細(xì)胞中瞬時表達。2.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG_2細(xì)胞相較于對照組而言,q RTPCR顯示E-cadhrin m RNA表達下調(diào)、N-cadherin m RNA表達上調(diào)。Western blot結(jié)果顯示E-cadhrin蛋白水平表達下調(diào)、N-cadherin蛋白水平表達上調(diào)。同時E-cadhrin的蛋白表達隨著丙肝NS4B表達的增加而減少,N-cadherin蛋白的表達隨著丙肝NS4B表達的增加而增加,說明NS4B蛋白表達是引起上皮細(xì)胞間質(zhì)改變的根本原因。3.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG_2細(xì)胞相較于對照組而言,Westernblot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄因子Snail表達上調(diào),且Snail隨著丙肝NS4B蛋白表達增加而增加,但q RT-PCR結(jié)果顯示表達丙肝NS4B組和對照組其snail m RNA表達水平相差不大,說明Snail蛋白變化發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平;沉默snail表達可扭轉(zhuǎn)HepG_2細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)改變。4.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG_2細(xì)胞遷徙能力較未轉(zhuǎn)染組增強,而共轉(zhuǎn)染NS4B質(zhì)粒和Snail sh RNA的HepG_2細(xì)胞遷徙能力并未明顯增加。5.轉(zhuǎn)染了重組NS4B質(zhì)粒的HepG_2細(xì)胞與對照組相比,可與Scribble蛋白相互作用并導(dǎo)致其表達下調(diào),Scribble下游Hippo信號通路中pyap蛋白表達下調(diào),但total-yap表達無明顯變化,p-yap/total-yap減少,Hippo信號通路被抑制,而p-akt表達上調(diào),total-akt表達下調(diào),p-akt/total-akt表達增加,說明Hippo下游通路PI3K/AKT信號通路被激活,這可能是丙肝NS4B導(dǎo)致肝細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)改變的分子機制。結(jié)論:丙肝非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達進而導(dǎo)致肝細(xì)胞上皮細(xì)胞間質(zhì)改變,且可能通過Scribble-Hippo-PI3K/AKT通路引起Snail表達變化。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R446.6;R512.63
【圖文】：

coding region,NCR)，在病毒復(fù)制中起著重要的調(diào)節(jié)作用，5’端 UTR具有內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES)，可介導(dǎo)HCV 病毒復(fù)制[9]，HCV ORF 含有 9個基因區(qū)，可編碼十個 HCV 蛋白，這十個蛋白包括三個結(jié)構(gòu)蛋白(核心蛋白、包膜蛋白 E1 和 E2)，和一個穿孔蛋白 p7 以及 6個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2, NS3, NS4A, NS4B,NS5A, NS5B)(圖 1)[10]，這些蛋白在 HCV 生活史中均發(fā)揮著重要的作用：E1和 E2 蛋白在 HCV 進入宿主細(xì)胞過程中起著重要的作用；核心蛋白構(gòu)成 HCV 核衣殼并且與多種宿主蛋白相互作用導(dǎo)致慢性化和 HCC 的發(fā)生[11]；p7 和 NS2 參與 HCV 病毒組裝和釋放[12]；NS3-NS5B 蛋白構(gòu)成病毒復(fù)制酶體并且也參與丙肝病理變化過程[13]。

信號通路o 信號通路是與器官大小、組織再生和腫瘤的發(fā)生抑制信號相關(guān)途徑 ，主要成分包括 YAP（Yes -a、Lats1/2、Mob、 Mst1/2、Sav、Merlin、Ex1/2 和磷酸化級聯(lián)放大途徑。磷酸化的 Hpo(哺乳動物 m，活化的 Hpo 能磷酸化 YKI(哺乳動物為 YAP)，活，進而滯留于細(xì)胞質(zhì)間，可阻止 YKI 與 scallopax 等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進而阻止 hippo 通路靶向基因DIAP1 等蛋白的表達，這些蛋白均有促進生長和ippo 信號通路圖見圖 2。

HCV 誘導(dǎo)的 DMVs 模型及假想的膜與各蛋白之間的關(guān)系(注：DMVs 含有V 非結(jié)構(gòu)蛋白和 HCV RNA，為 RNA 復(fù)制位點，DMVs 含有一開口，以便病NA、非結(jié)構(gòu)蛋白和細(xì)胞質(zhì)交換)[42]HCV NS4B 蛋白可以改變細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成，NS4B 蛋白可通過 PI3K/AKT 途徑刺激固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatoryment binding proteins, SREBPs)和脂肪合成酶的表達，以此誘導(dǎo)Vs 的形成[43]。DMVs 的形成也需要宿主蛋白的參與，NS4B蛋白NS5A 相互作用，可招募 PSTPIP2 蛋白到達 HCV 構(gòu)造的膜上，當(dāng)TPIP2 被敲出時，DMVs 的形成受阻[44]。NS4B蛋白還可和其他非蛋白相互作用以完成病毒復(fù)制周期，如 NS4B與 NS5A 相互作減少 NS4B向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)轉(zhuǎn)位[45]。NS4B C 末端的 walker B 基序

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本文編號：2769796