【摘要】：急性放射病(acute radiation sickness,ARS)是機體在短時間內(nèi)受到大劑量電離輻射照射引起的全身性疾病。其中骨髓型急性放射病(1Gy劑量10Gy)是輻射損傷最為常見,也最易治療的一種類型。造血干細胞移植是目前臨床治療此病的主要方法,但實際應(yīng)用中仍受到造血干細胞來源少、GVHD嚴重等因素的制約。因此,擴大造血干細胞來源,改善移植后GVHD對造血干細胞移植治療急性放射病有重要作用。單倍體造血干細胞來源廣泛,能有效解決造血干細胞來源少,配型時間長的問題。但單倍體造血干細胞移植仍然面臨植入失敗率高、GVHD重、移植相關(guān)死亡率高等諸多障礙。提高植入率、抑制GVHD發(fā)生是現(xiàn)在急需解決的問題。間充質(zhì)干細胞具有免疫抑制、支持造血干細胞擴增的作用,在造血干細胞移植中的輔助作用越來越受到重視�，F(xiàn)在骨髓、臍帶、真皮、脂肪等來源的間充質(zhì)干細胞均已被分離鑒定,因此,本課題將不同來源的間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞移植來治療重度骨髓型放射病,從造血重建、GVHD防治方面比較各種間充質(zhì)干細胞的優(yōu)劣,并對其機制進行初步探討,為間充質(zhì)干細胞的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。一、主要研究內(nèi)容與方法:1、構(gòu)建單倍體移植重度骨髓型放射病模型。采用C57BL/6(H-2b)與BALB/C(H-2d)雜交第一代(H-2b×d)小鼠作為受體,C57BL/6(H-2b)作為供體。設(shè)置不同劑量的輻照強度,對不同劑量輻照的小鼠進行移植,觀察并檢測小鼠造血重建、生存率、臨床評分、移植后嵌合率、骨髓細胞集落形成能力及病理。2、體外分離培養(yǎng)骨髓,臍帶,真皮和脂肪間充質(zhì)干細胞,采用分子標記(CD14/CD20/CD34/CD45,CD105,CD73,CD90)和成骨成脂分化能力檢測其間充質(zhì)干細胞的純度。將傳代培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞與人外周血T細胞共培養(yǎng),觀察T細胞的周期、增殖以及細胞亞群變化。3、構(gòu)建間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞移植重度骨髓型放射病GVHD模型。設(shè)置不同劑量間充質(zhì)干細胞(0.5×10~6、1×10~6和5×10~6),檢測移植后體重變化、生存率。利用CM-DIL標記間充質(zhì)干細胞,冰凍切片檢測間充質(zhì)干細胞在小鼠體內(nèi)的歸巢情況。4、將四種來源的間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞分別移植重度骨髓型放射病GVHD模型小鼠,檢測移植后造血重建能力、生存率、臨床評分。取移植后第28天小鼠GVHD靶器官,行病理切片HE染色和免疫組化檢測CD4和CD8的表達;檢測小鼠第28天T細胞亞群情況;檢測外周血血清中各細胞因子的表達情況。5、取對數(shù)期生長的各種間充質(zhì)干細胞,抽提RNA后,進行RNA-seq測序,分析不同間充質(zhì)干細胞基因表達的差異。二、結(jié)果:1、選擇800c Gy作為輻照劑量,成功構(gòu)建單倍體移植重度骨髓型放射病模型。2、成功分離培養(yǎng)四種間充質(zhì)干細胞的鑒定結(jié)果顯示,四種細胞的分子標記均符合間充質(zhì)干細胞標準(CD14/CD20/CD34/CD45-,CD105+,CD73+,CD90+)且均能誘導(dǎo)分化為骨細胞和脂肪細胞。共培養(yǎng)結(jié)果顯示四種細胞均能抑制T細胞增殖,增加G1期細胞比例。共培養(yǎng)后T細胞亞群檢測發(fā)現(xiàn),四種細胞均能抑制Th1、促進Th2增殖,且能提高Treg細胞的比例,其中HUCMSCs效果最顯著。3、成功構(gòu)建間充質(zhì)干細胞聯(lián)合單倍體造血干細胞移植重度骨髓型放射病GVHD模型。采用CM-DIL標記后的臍帶間充質(zhì)干細胞進行聯(lián)合移植,結(jié)果顯示臍帶間充質(zhì)干細胞能歸巢到脾臟、肝臟、肺和骨髓,其中骨髓最為豐富。4、聯(lián)合移植后結(jié)果顯示,間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植組生存率增加,臨床評分降低,HUCMSCs明顯優(yōu)于其他各組(P0.05)。病理與免疫組化結(jié)果顯示,間充質(zhì)干細胞能明顯減輕GVHD。CD4在模型小鼠的皮膚和肺中浸潤較多,CD8在小腸中有大量表達。T細胞亞群檢測顯示HUCMSCs組和DMSCs組Th1細胞較GVHD組明顯降低(P0.05),Th2細胞明顯增多(P0.05),BMSCs組和Ad-MSCs組與GVHD組無顯著差異。Treg細胞檢測發(fā)現(xiàn)各間充質(zhì)干細胞組較GVHD組Treg細胞顯著升高(P0.05),其中HUCMSCs組和BMSCs組與GVHD組差異最大(P0.01);外周血血清檢測顯示IFN-γ、IL-2和TNF-α在正常組的表達水平均較低,GVHD組明顯升高(P0.01),四種間充質(zhì)干細胞組均比GVHD組明顯降低(P0.05);IL-4檢測顯示GVHD組較正常組明顯升高(P0.05),HUCMSCs組、DMSCs組和BMSCs組均比GVHD組高(P0.01)。5、RNA-seq結(jié)果顯示HUCMSCs與BMSCs、DMSCs和Ad-MSCs基因表達明顯不同,與GVHD、細胞粘附、細胞因子以及新陳代謝相關(guān)的通路有較大差異。三、結(jié)論:1、單倍體造血干細胞移植能有效治療重度骨髓型放射病。2、間充質(zhì)干細胞聯(lián)合移植能有效減輕GVHD,提高生存率,其中HUCMSCs效果最好。3、HUCMSCs與其他三種間充質(zhì)干細胞的基因表達不同,特別是與GVHD、細胞粘附和細胞因子相關(guān)通路的不同,可能是HUCMSCs效果較好的重要原因。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R818;R457.7
【圖文】：

500cGy、600cGy 和 700cGy全部存活，800cGy 組存活率為 60%，900cGy 組存活率為 20%（圖1-1）。圖 1-1 不同劑量輻照后模型小鼠生存曲線。左圖為單純注射 PBS 組（PBS control），右圖為造血干細胞移植組（HCT）各組分別于移植后第 7 天對各 PBS 組行骨髓病理切片，觀察骨髓組織造血情況，觀察發(fā)現(xiàn)，800cGy 和 900cGy 組小鼠骨髓造血組織明顯減少，增生程度降低，骨小梁破壞，有核細胞數(shù)量減少。而 500cGy、600cGy 和 700cGy 造血組織同樣有所減少，但不明顯（圖 1-2）。

圖 1-2 移植后第 7 天各 PBS 組骨髓病理（HE，200×）1.2.1.2 體重變化輻照后各組小鼠體重均有一個急性下降期，PBS 組在輻照后體重持續(xù)下降，存活的小鼠體重在第 14 天緩慢回升。各移植組在 7-14 天均有不同程度回升（圖 1-3）。圖 1-3 不同劑量輻照后模型小鼠體重變化。左圖為單純注射 PBS 組（PBS control），

22圖 1-3 不同劑量輻照后模型小鼠體重變化。左圖為單純注射 PBS 組（PBS control），右圖為造血干細胞移植組（HCT）1.2.1.3 外周血象照射后第 7 天，各組分別于移植后第 1、3、5、7、10、14、21、28 天監(jiān)測血象變化。第 1-5 天，各造血干細胞移植組外周血象急劇下

【參考文獻】

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本文編號：2767955