【摘要】：目的:近年來白色念珠菌(Candida Albicans,CA)生物膜感染導(dǎo)致的耐藥性日趨嚴(yán)重,研究表明生物膜的形成是該菌感染性、耐藥性不斷增強的重要因素。目前臨床多是采用大劑量的抗真菌藥物治療此類感染,從而進一步增加了耐藥性。而中藥由于其抗菌譜廣、抗菌作用明顯以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點,已成為目前抗感染治療的重要研究內(nèi)容。故本研究擬選擇中藥黃連的主要活性成分鹽酸小檗堿作為干預(yù)手段,通過分析該活性成分對白色念珠菌生物膜形成表型和關(guān)鍵基因表達的影響,初步探討鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜的抑制作用及其分子機制,為臨床選擇鹽酸小檗堿輔助用于白色念珠菌生物膜感染的預(yù)防和治療提供前期實驗依據(jù)。方法:1.通過微量稀釋法測定鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC);通過構(gòu)建白色念珠菌體外生物膜模型,并采用XTT法作生物膜生長動力學(xué)評價、hochest染色法觀察菌絲形成動態(tài)過程,明確本實驗室條件下生物膜構(gòu)建條件以及芽管/菌絲形成時間。2.通過XTT法和激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)技術(shù)檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿干預(yù)下白色念珠菌生物膜膜內(nèi)細(xì)胞代謝活性、生物膜微觀形態(tài)和厚度的變化,研究鹽酸小檗堿對白色念珠菌生物膜形成的抑制作用。3.通過hochest染色法檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿干預(yù)下白色念珠菌菌絲形成的變化,研究藥物對白色念珠菌菌絲形成的抑制作用,并進一步驗證菌絲相與生物膜形成之間的關(guān)系。4.采用RT-PCR技術(shù)檢測高、中、低濃度(4MIC、MIC、1/4MIC)鹽酸小檗堿對菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)表達的影響,研究基因、藥物、菌絲以及生物膜形成之間的關(guān)系,探尋鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生物膜形成的分子調(diào)節(jié)機制。結(jié)果:1.鹽酸小檗堿對白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231和臨床菌株CA2119浮游菌具有明顯的抑制作用,其MIC均為32μg/mL;成功構(gòu)建體外生物膜模型,且確定了早期、中期和成熟期生物膜形成時間,分別為0-6h,6-24h和24-48h,芽管/菌絲形成時間在4-6h。2.對于ATCC10231和CA2119早期(4h、6h)生物膜:與對照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿可以明顯抑制生物膜膜內(nèi)細(xì)胞活性、破壞其微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)以及降低生物膜厚度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但8μg/mL鹽酸小檗堿僅對ATCC10231有明顯的抑制作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),對CA2119無明顯抑制作用;與4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用明顯優(yōu)于氟康唑,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但32μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用不及氟康唑;并且與ATCC10231相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿對CA2119生物膜內(nèi)細(xì)胞活性以及生物膜厚度的抑制率較ATCC10231低,表明鹽酸小檗堿對ATCC10231的抑制效果優(yōu)于CA2119;同時鹽酸小檗堿對ATCC10231的6h早期生物膜較4h早期生物膜抑制效果更為顯著,提示6h早期生物膜可能是鹽酸小檗堿抑制細(xì)胞活性的適宜時間。3.對于ATCC10231和CA2119的酵母相細(xì)胞:與對照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿均能明顯抑制白色念珠菌從酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)化,其菌量減少,菌絲形成受阻,而8μg/mL鹽酸小檗堿無明顯抑制作用。4.對于ATCC10231早期生物膜:與對照組相比,128μg/mL和32μg/mL鹽酸小檗堿均能明顯抑制4h和6h早期生物膜菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而8μg/mL鹽酸小檗堿則無明顯抑制作用。與4μg/mL氟康唑相比,128μg/mL鹽酸小檗堿對4h生物膜的抑制作用明顯優(yōu)于氟康唑,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。對于CA2119早期生物膜:與對照組比,128μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制6h早期生物膜菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),32μg/mL和8μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制HWP1和ECE1的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但對4h早期生物膜,128μg/mL鹽酸小檗堿無明顯抑制作用,32μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制Efg1和ALS1的表達,而8μg/mL鹽酸小檗堿可以抑制HWP1和ECE1的表達,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.高濃度與中濃度鹽酸小檗堿可以通過殺滅生物膜膜內(nèi)細(xì)胞、破壞生物膜完整結(jié)構(gòu)從而抑制白色念珠菌生物膜的形成,其作用機制可能是通過下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因(Efg1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達,阻延白色念珠菌發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化,影響生物膜形成關(guān)鍵物質(zhì)-菌絲的形成實現(xiàn)的。2.鹽酸小檗堿對臨床菌株表型以及關(guān)鍵基因的表達具有一定的抑制效果,但抑制效果不及標(biāo)準(zhǔn)菌株,提示鹽酸小檗堿對臨床菌株的干預(yù)作用還存在許多問題,需要進一步擴大樣本研究探討,耐藥性的產(chǎn)生可能會增強機體對其他抗真菌藥物的抵抗性。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5
【圖文】：

圖 2-1 ATCC10231 生物膜細(xì)胞生長曲線 白色念珠菌芽管/菌絲形成動態(tài)過程實驗用 hochest 染色法對培養(yǎng) 0-8h 的白色念珠菌進行染色，從而觀察形成過程，結(jié)果見圖 2-2。白色念珠菌在培養(yǎng) 2h 左右形成大量芽生孢

ATCC10231菌絲形成過程（熒光倒置顯微鏡，400倍×）

圖 2-1 鹽酸小檗堿對不同階段鹽酸小檗堿膜內(nèi)細(xì)胞活性的抑制率A 表示與 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，a 表示與 ATCC10231 6h 生物膜相比，p<0.05與 ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，b 表示與 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05，C 表示ATCC102314h 生物膜相比，p<0.05，c 表示與 ATCC102316h 生物膜相比，p<0.05.2 各藥物干預(yù)組中白色念珠菌生物膜微觀形態(tài)和厚度的變化

【參考文獻】

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本文編號：2762900