本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌休眠模型的建立及其耐藥性和HBHA表達(dá)的分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病,當(dāng)前全球結(jié)核病疫情嚴(yán)峻,耐藥問題突出,深入探討結(jié)核分枝桿菌的耐藥對于結(jié)核病的防治尤為重要。研究表明當(dāng)結(jié)核分枝桿菌受到不適宜環(huán)境刺激后,dev S-R雙組份系統(tǒng)可以調(diào)控結(jié)核菌進(jìn)入休眠狀態(tài),發(fā)生基因突變產(chǎn)生耐藥。本實(shí)驗(yàn)組前期工作發(fā)現(xiàn)臨床耐藥菌株中休眠調(diào)節(jié)因子dev R表達(dá)增強(qiáng),并且在蛋白分析中發(fā)現(xiàn)Dev R及其調(diào)控基因的蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)。通過進(jìn)一步的藥物誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)常用抗結(jié)核藥物可以誘導(dǎo)dev R的表達(dá)升高,說明dev S-R雙組份系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌耐藥關(guān)系密切。因此,我們設(shè)想在前期工作的基礎(chǔ)上,建立結(jié)核分枝桿菌的休眠模型,探討結(jié)核分枝桿菌休眠引起的耐藥與hbh A表達(dá)的變化。方法:1.結(jié)核分枝桿菌體外休眠模型的建立及鑒定BCG野生株,經(jīng)過“微氧+10%Dubos+p H5.0”環(huán)境37℃培養(yǎng)18天,分別取常規(guī)培養(yǎng)和第4、7、10、14和18天菌株測定600 nm下的吸光度(A)值繪制生長曲線,并進(jìn)行金胺O-尼羅紅雙熒光染色和休眠相關(guān)基因hsp X、dev R等的表達(dá)量檢測。2.休眠結(jié)核分枝桿菌的耐藥性鑒定BCG菌株休眠培養(yǎng),分別取常規(guī)培養(yǎng)和第4、7、10、14和18天菌株進(jìn)行刃天青顯色藥敏檢測。挑取耐藥單克隆菌落提取其DNA,進(jìn)行7種常見耐藥相關(guān)基因(kat G、emb B、rps L、rpo B、gyr A、ahp C和inh A)測序。3.休眠結(jié)核分枝桿菌hbh A的表達(dá)分析BCG野生株和dev R缺失株分別經(jīng)過常規(guī)培養(yǎng)和休眠培養(yǎng),取常規(guī)培養(yǎng)和第4、7、10、14和18天菌株測定其生長曲線和進(jìn)行金胺O-尼羅紅雙熒光染色比較。利用RT-PCR檢測分析兩種菌株hbh A基因的表達(dá)情況。結(jié)果:1.結(jié)核分枝桿菌體外休眠模型的建立及鑒定休眠培養(yǎng)過程中,BCG菌株的生長速度與常規(guī)培養(yǎng)菌株相比明顯減慢(P0.01);菌體抗酸性逐漸減弱,脂質(zhì)累積逐漸增強(qiáng);休眠相關(guān)基因hsp X、dev R表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào),且培養(yǎng)第18天菌株明顯高于常規(guī)培養(yǎng)菌株(P0.05)。2.休眠結(jié)核分枝桿菌的耐藥性鑒定刃天青顯色藥敏結(jié)果顯示,結(jié)核分枝桿菌休眠培養(yǎng)的第18天異煙肼的MIC濃度是最初濃度的93.33倍;休眠培養(yǎng)的第18天利福平的MIC濃度是最初濃度的22.50倍。常見耐藥相關(guān)基因測序均未出現(xiàn)突變。3.休眠結(jié)核分枝桿菌hbh A的表達(dá)分析BCG野生株和dev R缺失株經(jīng)過休眠培養(yǎng)生長速度與常規(guī)培養(yǎng)相比均出現(xiàn)明顯減慢(P0.01)。熒光染色可以看出BCG野生株經(jīng)過休眠培養(yǎng),菌體逐漸進(jìn)入休眠狀態(tài);而dev R缺失株經(jīng)過培養(yǎng)菌體仍處于活化狀態(tài)。BCG野生株在休眠條件培養(yǎng)過程中hbh A基因表達(dá)逐漸上調(diào),且培養(yǎng)第18天菌株表達(dá)量明顯高于常規(guī)培養(yǎng)菌株(P0.05);dev R敲除株在休眠條件培養(yǎng)過程中hbh A基因表達(dá)逐漸下調(diào),且培養(yǎng)第18天菌株表達(dá)量明顯低于常規(guī)培養(yǎng)菌株(P0.05)。除此之外,休眠培養(yǎng)第18天dev R敲除株(0.30±0.07)的hbh A表達(dá)量明顯低于BCG野生株(1.86±0.25)。結(jié)論:本研究通過“微氧+10%Dubos+p H5.0”壓力條件培養(yǎng)并檢測休眠相關(guān)基因hsp X、dev R表達(dá)量確認(rèn)BCG菌株休眠模型成功建立;進(jìn)而證實(shí)BCG菌株休眠后在沒有基因突變的情況下MIC濃度增加,出現(xiàn)表型耐藥;通過RT-PCR檢測BCG野生株與dev R敲除株hbh A基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)BC G野生株休眠后hbh A表達(dá)增強(qiáng),而dev R敲除株表達(dá)減弱,證明了休眠與耐藥及hbh A之間密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 休眠 耐藥 hspX基因 dev R基因 hbhA基因
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R52;R446.5
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-27
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌體外休眠模型的建立27-45
• 1 材料27-30
• 1.1 菌株27
• 1.2 主要儀器設(shè)備27-28
• 1.3 主要試劑28-29
• 1.4 培養(yǎng)基、試劑和緩沖液配制29-30
• 2 方法30-37
• 2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定30-32
• 2.2 結(jié)核分枝桿菌的休眠培養(yǎng)32-33
• 2.3 休眠培養(yǎng)菌株鑒定33-37
• 2.4 統(tǒng)計37
• 3 結(jié)果37-43
• 3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定37-38
• 3.2 休眠培養(yǎng)菌株鑒定38-43
• 4 討論43-45
• 第二部分 休眠結(jié)核分枝桿菌的耐藥性鑒定45-58
• 1 材料45-47
• 1.1 菌株45
• 1.2 主要儀器設(shè)備45
• 1.3 主要試劑45-46
• 1.4 試劑、緩沖液配制46-47
• 2 方法47-50
• 2.1 休眠菌株培養(yǎng)47
• 2.2 刃天青藥敏檢測47-48
• 2.3 耐藥菌株測序48-50
• 3 結(jié)果50-56
• 3.1 刃天青藥敏檢測50-55
• 3.2 休眠菌株測序55-56
• 4 討論56-58
• 第三部分 休眠結(jié)核分枝桿菌HBHA的表達(dá)分析58-66
• 1 材料58-60
• 1.1 菌株58-59
• 1.2 主要儀器設(shè)備59
• 1.3 主要試劑59
• 1.4 培養(yǎng)基、試劑和緩沖液配制59-60
• 2 方法60-62
• 2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定60
• 2.2 RT-PCR觀察不同菌株休眠狀態(tài)下hbhA基因的表達(dá)水平60-62
• 2.3 統(tǒng)計62
• 3 結(jié)果62-64
• 3.1 BCG野生株、devR缺失株生長特性鑒定62
• 3.2 BCG野生株、devR缺失株休眠培養(yǎng)金胺O-尼羅紅熒光染色比較62-64
• 3.3 BCG野生株、devR敲除株休眠培養(yǎng)過程中hbhA基因的表達(dá)64
• 4 討論64-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-75
• 個人簡歷和研究成果75-76
• 致謝76

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本文編號：275769