【摘要】：背景與目的感染性休克的主要臨床表現(xiàn)就是敗血癥。由于敗血癥呈現(xiàn)出高度變化的臨床特征,使得精確的早期診斷變得比較困難,晚期診斷和延遲治療會大大增加死亡率。生物標志物是潛在的有價值的臨床工具,雖然已經(jīng)有許多早期診斷敗血癥生物標記的研究,但是大部分沒有被采納或者在臨床實驗中被證明有效。為了在敗血癥中發(fā)現(xiàn)新的診斷和預后指標,基因組學的方法被應用到敗血癥研究當中,結果顯示許多miRNA都可以作為炎癥反應的關鍵調控因子。miRNA作為免疫應答的調節(jié)器,在敗血癥當中有著重要的轉錄調控作用。雖然越來越多的研究表明許多miRNA在敗血癥當中是高表達的,但是這些分子在敗血癥中的病理學機制并未研究透徹。有研究表明miR-21-3p在LPS誘導的敗血癥相關的心臟功能紊亂中是高表達的,通過antagomiR對miR-21-3p進行藥理性抑制后能夠提高小鼠的生存率,但是具體機制還不是很清楚。因此本實驗中研究了miR-21在內毒素休克中的作用并對其調節(jié)機制進行了探討。方法體內實驗對miR-21 KO鼠和WT腹腔注射LPS誘導內毒素炎癥性休克模型,監(jiān)測48 h內小鼠的存活情況并記錄繪制生存曲線。另外LPS注射6 h后ELISA檢測小鼠外周血血清中IL-1β和IL-18含量,同時用PBS清洗小鼠腹腔并吸出,離心獲得腹腔巨噬細胞并對腹腔巨噬細胞進行流式檢測M1和M2巨噬細胞的比例。為了更加直觀看到miR-21敲除后對內毒素休克的影響,對小鼠進行腹腔注射LPS 12 h后對小鼠肝臟、脾臟和腎臟進行HE染色觀察炎癥細胞的浸潤情況。caspase-1的激活會導致IL-1β和IL-18的成熟和分泌,體外實驗通過western檢測小鼠BMDM在NLRP3炎癥小體激活時caspase-1的活化情況,同時利用ELISA檢測caspase-1激活時相應成熟IL-1β的分泌情況。對miR-21 KO和WT BMDM進行LPS預刺激4 h后采用ATP或尼日利亞桿菌刺激0 min,10 min,20 min,30 min,60 min后western檢測caspas-1活化趨勢,同時對應時間點的細胞上清用來檢測caspase-1活化后IL-1β的分泌和LDH含量。在本實驗中為了排除轉染試劑和siRNA對AIM2炎癥小體激活的影響,我們向BMDM中轉染了dsDNA,通過western檢測加入dsDNA后caspase-1的活化情況并利用ELISA檢測細胞上清中IL-1β和LDH含量。有研究表明A20是NLRP3炎癥小體的一個負向調節(jié)器,在隨后的實驗中我們通過western和qRT-PCR檢測了miR-21 KO和WT BMDM中A20、NLRP3、caspase-1和ASC的表達情況,同時利用熒光素酶報告基因實驗和qRT-PCR實驗驗證A20是miR-21的靶基因。隨后通過向miR-21 KO BMDM中轉染si-A20,western和qRT-PCR檢測NLRP3、caspase-1和ASC的表達,通過ELSA檢測細胞上清的IL-1β分泌。大量的研究結果表明NLRP3炎癥小體相關的caspase-1與線粒體功能失調相關。在本研究中通過檢測ROS確定線粒體受損情況。caspase-1的激活會切割GSDMD,產(chǎn)生一個GSDMD-N,它是促使細胞焦亡的直接片段。我們通過向BMDM細胞轉染Flag-GSDMD慢病毒,使用anti-Flag western檢測GSDMD的切割情況,同時采用直接使用anti-GSDMD檢測GSDMD的切割情況。結果體內實驗中生存曲線結果顯示在miR-21敲除后小鼠的存活情況明顯優(yōu)于對照組,血清中的IL-β和IL-18含量及腹腔巨噬細胞比例少于對照組,肝臟、脾臟和腎臟組織HE染色顯示miR-21 KO組的炎癥細胞浸潤明顯少于對照組。體外實驗結果表明NLRP3炎癥小體在被LPS激活后能夠導致caspase-1的活化,而caspase-1的激活會促進IL-1β的成熟和分泌。這一趨勢會隨著ATP或者尼日利亞桿菌激活NLRP3炎癥小體的時間增長而加強。在miR-21 KO BMDM中,A20高表達,同時NLRP3、caspase-1和ASC在mRNA水平和蛋白水平低表達。A20是miR-21的一個靶基因,當在miR-21 KO BMDM中敲低A20后會恢復NLRP3、caspase-1和ASC的表達水平。在miR-21 KO BMDM中ROS的釋放明顯少于對照組。在caspase-1活化的同時發(fā)生了GSDMD-N誘導的細胞焦亡,但miR-21 KO組巨噬細胞的焦亡程度明顯低于對照組。結論上述結果表明,miR-21敲除后在體內和體外都可以明顯緩解LPS誘導的內毒素休克反應,降低炎癥反應的程度。其機制是miR-21通過調節(jié)A20進而調節(jié)炎癥小體影響細胞焦亡的發(fā)生,最終影響IL-1β分泌。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7
【圖文】：

4圖 1 NLRP3 炎癥小體激活信號通路圖（四）miRNA 與敗血癥miRNA 是一種小的非編碼 RNA，大約 22 個核苷酸的長度[27]。每種 miRNA都能調控幾種靶基因的表達，并參與許多重要的過程，例如胚胎發(fā)育、免疫應答、炎癥、腫瘤發(fā)生以及細胞生長和增殖[28]。也有研究表明在調節(jié)免疫系統(tǒng)功能方面具有重要作用[29]。在未激活的 T 細胞和抗原提呈細胞中的表達維持在較低水平，但是當這些細胞被激活以后的表達大幅升高[30-32]。新的研究表明有促炎作用，在許多自身免疫疾病如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中具有重要作用。miRNA 的表達受許多胞內和胞外信號分子的調控。全反式視黃酸、PMA、GM-CSF、IL-4[33, 34]、LPS[35]都可以誘導單核細胞中的表達。因此，可以視為免疫細胞活化的一個重要標志物。成熟 miRNA 的種(Anand PK et.al.Frontiers in microbiology.2011)

圖 2 作為膿毒癥標志物的免疫 miRNAs 的作用機制（五）CRISPR-Cas9 技術本實驗中的 miR-21 KO 鼠是通過 CRISPR-Cas9 的方法獲得的。作為一種RNA 引導的基因組編輯工具，CRISPR-Cas9 第一次應用到哺乳動物的器官組織當中是在 2013 年，相比于其他傳統(tǒng)的基因工具來說 CRISPR-Cas9 有許多優(yōu)勢，比如設計簡單、方便使用和操作（能夠同時編輯不同基因）。隨后 CRISPR-Cas9成為了包括基因治療研究在內的各種基因編輯的既方便又物有所值的工具。在細胞系或者動物模型中，CRISPR-Cas9 可以通過不同的方法實現(xiàn)不同的治療目的。它可以糾正單基因突變從而緩解疾病，也可以編輯病原體的基因組比如 HIV實現(xiàn)治療目的，或者在宿主組織誘導保護性和治療性突變。此外在基因治療癌癥上它也具有很大潛能比如抑制致瘤基因活性或者誘導致癌基因抑制子的表達。對生殖細胞進行基因修飾是在動物模型當中研究基因治療的一種傳統(tǒng)手段。比如在杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（一種遺傳性 X 染色體相關的單基因疾�。┑膭游�(Giza DE et.al.Cell Death and Differentiation.2016)

%酒精20 s——95%酒精30 s——無水乙醇1 min——二甲苯Ⅱ8。據(jù)處理和統(tǒng)計方法部數(shù)據(jù)輸入 Excel 建立數(shù)據(jù)庫，使用統(tǒng)計軟件進行分析。組內比’s unpaired t-test，以 p<0.05 表示各差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計ad Prism Version 5.0來完成。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.1software進果iR-21 敲除后小鼠生存情況明顯改善察 miR-21 KO 鼠在 LPS 誘導的敗血癥中的臨床表現(xiàn)我們通過腹 WT 鼠和基因敲除鼠進行等劑量的 LPS 注射，在隨后的 48 h 內生存情況進行檢測，并繪制生存曲線。我們使用 7 周齡健康的 miR-21 KO 鼠。小鼠體重均在 18-20 g 范圍內，注射的 LPS 濃結果表明在腹腔注射 LPS 8 h 后，兩組小鼠的生存情況開始出現(xiàn)時 WT 組鼠全部死亡，而 miR-21 敲除鼠生存率明顯高于 WT 組

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