【摘要】：背景與目的感染性休克的主要臨床表現(xiàn)就是敗血癥。由于敗血癥呈現(xiàn)出高度變化的臨床特征,使得精確的早期診斷變得比較困難,晚期診斷和延遲治療會大大增加死亡率。生物標(biāo)志物是潛在的有價值的臨床工具,雖然已經(jīng)有許多早期診斷敗血癥生物標(biāo)記的研究,但是大部分沒有被采納或者在臨床實驗中被證明有效。為了在敗血癥中發(fā)現(xiàn)新的診斷和預(yù)后指標(biāo),基因組學(xué)的方法被應(yīng)用到敗血癥研究當(dāng)中,結(jié)果顯示許多miRNA都可以作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子。miRNA作為免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)器,在敗血癥當(dāng)中有著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。雖然越來越多的研究表明許多miRNA在敗血癥當(dāng)中是高表達的,但是這些分子在敗血癥中的病理學(xué)機制并未研究透徹。有研究表明miR-21-3p在LPS誘導(dǎo)的敗血癥相關(guān)的心臟功能紊亂中是高表達的,通過antagomiR對miR-21-3p進行藥理性抑制后能夠提高小鼠的生存率,但是具體機制還不是很清楚。因此本實驗中研究了miR-21在內(nèi)毒素休克中的作用并對其調(diào)節(jié)機制進行了探討。方法體內(nèi)實驗對miR-21 KO鼠和WT腹腔注射LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素炎癥性休克模型,監(jiān)測48 h內(nèi)小鼠的存活情況并記錄繪制生存曲線。另外LPS注射6 h后ELISA檢測小鼠外周血血清中IL-1β和IL-18含量,同時用PBS清洗小鼠腹腔并吸出,離心獲得腹腔巨噬細(xì)胞并對腹腔巨噬細(xì)胞進行流式檢測M1和M2巨噬細(xì)胞的比例。為了更加直觀看到miR-21敲除后對內(nèi)毒素休克的影響,對小鼠進行腹腔注射LPS 12 h后對小鼠肝臟、脾臟和腎臟進行HE染色觀察炎癥細(xì)胞的浸潤情況。caspase-1的激活會導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟和分泌,體外實驗通過western檢測小鼠BMDM在NLRP3炎癥小體激活時caspase-1的活化情況,同時利用ELISA檢測caspase-1激活時相應(yīng)成熟IL-1β的分泌情況。對miR-21 KO和WT BMDM進行LPS預(yù)刺激4 h后采用ATP或尼日利亞桿菌刺激0 min,10 min,20 min,30 min,60 min后western檢測caspas-1活化趨勢,同時對應(yīng)時間點的細(xì)胞上清用來檢測caspase-1活化后IL-1β的分泌和LDH含量。在本實驗中為了排除轉(zhuǎn)染試劑和siRNA對AIM2炎癥小體激活的影響,我們向BMDM中轉(zhuǎn)染了dsDNA,通過western檢測加入dsDNA后caspase-1的活化情況并利用ELISA檢測細(xì)胞上清中IL-1β和LDH含量。有研究表明A20是NLRP3炎癥小體的一個負(fù)向調(diào)節(jié)器,在隨后的實驗中我們通過western和qRT-PCR檢測了miR-21 KO和WT BMDM中A20、NLRP3、caspase-1和ASC的表達情況,同時利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛁RT-PCR實驗驗證A20是miR-21的靶基因。隨后通過向miR-21 KO BMDM中轉(zhuǎn)染si-A20,western和qRT-PCR檢測NLRP3、caspase-1和ASC的表達,通過ELSA檢測細(xì)胞上清的IL-1β分泌。大量的研究結(jié)果表明NLRP3炎癥小體相關(guān)的caspase-1與線粒體功能失調(diào)相關(guān)。在本研究中通過檢測ROS確定線粒體受損情況。caspase-1的激活會切割GSDMD,產(chǎn)生一個GSDMD-N,它是促使細(xì)胞焦亡的直接片段。我們通過向BMDM細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag-GSDMD慢病毒,使用anti-Flag western檢測GSDMD的切割情況,同時采用直接使用anti-GSDMD檢測GSDMD的切割情況。結(jié)果體內(nèi)實驗中生存曲線結(jié)果顯示在miR-21敲除后小鼠的存活情況明顯優(yōu)于對照組,血清中的IL-β和IL-18含量及腹腔巨噬細(xì)胞比例少于對照組,肝臟、脾臟和腎臟組織HE染色顯示miR-21 KO組的炎癥細(xì)胞浸潤明顯少于對照組。體外實驗結(jié)果表明NLRP3炎癥小體在被LPS激活后能夠?qū)е耤aspase-1的活化,而caspase-1的激活會促進IL-1β的成熟和分泌。這一趨勢會隨著ATP或者尼日利亞桿菌激活NLRP3炎癥小體的時間增長而加強。在miR-21 KO BMDM中,A20高表達,同時NLRP3、caspase-1和ASC在mRNA水平和蛋白水平低表達。A20是miR-21的一個靶基因,當(dāng)在miR-21 KO BMDM中敲低A20后會恢復(fù)NLRP3、caspase-1和ASC的表達水平。在miR-21 KO BMDM中ROS的釋放明顯少于對照組。在caspase-1活化的同時發(fā)生了GSDMD-N誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,但miR-21 KO組巨噬細(xì)胞的焦亡程度明顯低于對照組。結(jié)論上述結(jié)果表明,miR-21敲除后在體內(nèi)和體外都可以明顯緩解LPS誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克反應(yīng),降低炎癥反應(yīng)的程度。其機制是miR-21通過調(diào)節(jié)A20進而調(diào)節(jié)炎癥小體影響細(xì)胞焦亡的發(fā)生,最終影響IL-1β分泌。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7
【圖文】：

4圖 1 NLRP3 炎癥小體激活信號通路圖（四）miRNA 與敗血癥miRNA 是一種小的非編碼 RNA，大約 22 個核苷酸的長度[27]。每種 miRNA都能調(diào)控幾種靶基因的表達，并參與許多重要的過程，例如胚胎發(fā)育、免疫應(yīng)答、炎癥、腫瘤發(fā)生以及細(xì)胞生長和增殖[28]。也有研究表明在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能方面具有重要作用[29]。在未激活的 T 細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞中的表達維持在較低水平，但是當(dāng)這些細(xì)胞被激活以后的表達大幅升高[30-32]。新的研究表明有促炎作用，在許多自身免疫疾病如Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中具有重要作用。miRNA 的表達受許多胞內(nèi)和胞外信號分子的調(diào)控。全反式視黃酸、PMA、GM-CSF、IL-4[33, 34]、LPS[35]都可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞中的表達。因此，可以視為免疫細(xì)胞活化的一個重要標(biāo)志物。成熟 miRNA 的種(Anand PK et.al.Frontiers in microbiology.2011)

圖 2 作為膿毒癥標(biāo)志物的免疫 miRNAs 的作用機制（五）CRISPR-Cas9 技術(shù)本實驗中的 miR-21 KO 鼠是通過 CRISPR-Cas9 的方法獲得的。作為一種RNA 引導(dǎo)的基因組編輯工具，CRISPR-Cas9 第一次應(yīng)用到哺乳動物的器官組織當(dāng)中是在 2013 年，相比于其他傳統(tǒng)的基因工具來說 CRISPR-Cas9 有許多優(yōu)勢，比如設(shè)計簡單、方便使用和操作（能夠同時編輯不同基因）。隨后 CRISPR-Cas9成為了包括基因治療研究在內(nèi)的各種基因編輯的既方便又物有所值的工具。在細(xì)胞系或者動物模型中，CRISPR-Cas9 可以通過不同的方法實現(xiàn)不同的治療目的。它可以糾正單基因突變從而緩解疾病，也可以編輯病原體的基因組比如 HIV實現(xiàn)治療目的，或者在宿主組織誘導(dǎo)保護性和治療性突變。此外在基因治療癌癥上它也具有很大潛能比如抑制致瘤基因活性或者誘導(dǎo)致癌基因抑制子的表達。對生殖細(xì)胞進行基因修飾是在動物模型當(dāng)中研究基因治療的一種傳統(tǒng)手段。比如在杜氏肌肉營養(yǎng)不良癥（一種遺傳性 X 染色體相關(guān)的單基因疾�。┑膭游�(Giza DE et.al.Cell Death and Differentiation.2016)

%酒精20 s——95%酒精30 s——無水乙醇1 min——二甲苯Ⅱ8。據(jù)處理和統(tǒng)計方法部數(shù)據(jù)輸入 Excel 建立數(shù)據(jù)庫，使用統(tǒng)計軟件進行分析。組內(nèi)比’s unpaired t-test，以 p<0.05 表示各差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計ad Prism Version 5.0來完成。流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.1software進果iR-21 敲除后小鼠生存情況明顯改善察 miR-21 KO 鼠在 LPS 誘導(dǎo)的敗血癥中的臨床表現(xiàn)我們通過腹 WT 鼠和基因敲除鼠進行等劑量的 LPS 注射，在隨后的 48 h 內(nèi)生存情況進行檢測，并繪制生存曲線。我們使用 7 周齡健康的 miR-21 KO 鼠。小鼠體重均在 18-20 g 范圍內(nèi)，注射的 LPS 濃結(jié)果表明在腹腔注射 LPS 8 h 后，兩組小鼠的生存情況開始出現(xiàn)時 WT 組鼠全部死亡，而 miR-21 敲除鼠生存率明顯高于 WT 組

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本文編號：2750508