【摘要】：結(jié)核病是危害人類(lèi)生命健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題,耐藥結(jié)核病的廣泛流行給結(jié)核病的預(yù)防與控制帶來(lái)了重大的挑戰(zhàn)�？焖贆z測(cè)耐多藥結(jié)核病(結(jié)核分枝桿菌至少對(duì)異煙肼和利福平耐藥)對(duì)臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。結(jié)核分枝桿菌的異質(zhì)性耐藥是指在一份結(jié)核患者樣本中,同時(shí)攜帶敏感型菌和耐藥型菌,對(duì)它的診斷需要建立一種高靈敏的檢測(cè)方法。本論文利用可以檢測(cè)低比例突變的DeepMelt方法,建立了結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變和耐多藥突變的高靈敏檢測(cè)體系。第一章,首先簡(jiǎn)述了結(jié)核病的流行概況、結(jié)核病的預(yù)防與控制、抗結(jié)核藥物的分類(lèi)、耐藥結(jié)核病的診斷和治療,然后介紹了結(jié)核分枝桿菌異質(zhì)性耐藥的特點(diǎn)和檢測(cè)要求,接著描述了多色熔解曲線分析技術(shù)檢測(cè)突變的原理和自淬滅探針的熒光標(biāo)記與修飾方法,最后提出了本論文的研究?jī)?nèi)容。第二章,以利福平耐藥基因?yàn)檠芯繉?duì)象,基于多色熔解曲線分析技術(shù),建立了單管四色利福平耐藥突變的高靈敏檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)了對(duì)利福平耐藥決定區(qū)域(Rifampicin resistance determining region,RRDR)內(nèi)突變的檢測(cè)。為保證四條探針對(duì)RRDR區(qū)域的全覆蓋檢測(cè),我們深入探究了探針的熒光/淬滅基團(tuán)的修飾方式、排布和熔點(diǎn)等影響因素,提出了一種新穎的探針設(shè)計(jì)方案。我們使用質(zhì)粒參考品考察體系的分析性能,高頻突變r(jià)poB 531TCGTTG異質(zhì)性耐藥檢出能力為1%突變,rpoB 526CACGAC、rpoB516GACGGC和 rpoB 511CTGCCG 的異質(zhì)性耐藥檢出能力分別為5%、10%和20%。最后,利用450份標(biāo)本對(duì)體系的臨床性能進(jìn)行評(píng)價(jià),以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),體系的靈敏度為93.84%,特異性為92.76%,Kappa值為0.85,說(shuō)明本體系與藥敏試驗(yàn)結(jié)果的一致性強(qiáng),適合臨床應(yīng)用。第三章,利用DeepMelt技術(shù),建立了結(jié)核分枝桿菌耐多藥突變的高靈敏檢測(cè)體系,實(shí)現(xiàn)了對(duì)異煙肼耐藥突變(katG315密碼子、inhA啟動(dòng)子和ahpC啟動(dòng)子)和RRDR區(qū)域突變的檢測(cè)。對(duì)8個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)的異質(zhì)性耐藥參考品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,高頻突變位點(diǎn)rpoB531TCGTTG和katG315AGCACC的檢測(cè)水平低至 l%,rpoB526CACGAC、rpoBB516GACGGC、inhA promoter-15CT、ahpC promoter-30CT 和 ahpC promoter-10CT 的檢測(cè)水平為 5%,rpoB 511CTGCCG的檢測(cè)水平為10%。最后,本研究收集了沈陽(yáng)、北京、河南、廣州四家臨床單位共1230份臨床標(biāo)本進(jìn)行多中心臨床評(píng)價(jià),以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)利福平與異煙肼耐藥檢測(cè)的靈敏度分別為95.67%、89.66%,特異性分別為94.27%、95.48%,Kappa值分別為0.875、0.85,整體耐多藥符合率為91.02%,本研究建立的耐多藥檢測(cè)體系簡(jiǎn)便快速、靈敏特異,且易于使用,有望應(yīng)用于臨床耐多藥結(jié)核的快速診斷。
【學(xué)位授予單位】：廈門(mén)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5
【圖文】：

１．３結(jié)核病的預(yù)防與控制逡逑呼吸道感染是結(jié)核的主要感染途徑，飛沫感染是最主要的感染方式［２７］，其感逡逑染路線如圖１－３所示，含有結(jié)核分枝桿菌的微滴能夠到達(dá)人體的呼吸道及肺部，逡逑引起結(jié)核感染［２８］。結(jié)核分枝桿菌從感染成功到最終發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，主要包逡逑括四個(gè)步驟：吞噬ＭＴＢ，邋ＭＴＢ的細(xì)胞內(nèi)增殖，潛伏性感染期和活動(dòng)性肺結(jié)核。逡逑這些步驟可以推進(jìn)到不同的臨床情景：自發(fā)治愈、疾病、潛伏感染的重新激活或逡逑重新感染［２９］。逡逑結(jié)核病在人群中流行的三個(gè)生物學(xué)環(huán)節(jié)為：傳染源、傳播途徑和易感人群？，逡逑３１］。因此要控制結(jié)核病的流行應(yīng)主要針對(duì)這三個(gè)環(huán)節(jié)。控制傳染源，即結(jié)核病患逡逑者要做到及時(shí)診斷，規(guī)范治療，各種醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得結(jié)核病不是不治之癥，逡逑每年有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的人成功治療結(jié)核�。粋鞑ネ緩降那袛�，主要依靠的感染患者的逡逑自覺(jué)性，出門(mén)佩戴口罩不隨地吐痰，少到人群密集的地方，以降低結(jié)核分枝桿菌逡逑的傳播；最后保護(hù)易感人群

第一章緒論逡逑而逐漸提高。為了實(shí)現(xiàn)基因的定性檢測(cè)，科學(xué)家在早期實(shí)時(shí)熒光ＰＣＲ的基礎(chǔ)上，逡逑又逐漸推出多色探針熔解曲線分析技術(shù)，探針熔解曲線是發(fā)生在擴(kuò)增結(jié)束后的一逡逑段連續(xù)升溫的過(guò)程，對(duì)于基因突變有更好的區(qū)分效果，而且大大提高了檢測(cè)通量。逡逑＿邐ＭＴ邋ＷＴ逡逑

的補(bǔ)償機(jī)制，且存在無(wú)義突變形式所以本體系暫不考慮和逡逑基因。以利福平基因的耐藥決定區(qū)域８１ｂｐ為對(duì)象，建立單管四色利福平耐逡逑藥突變的高靈敏檢測(cè)體系，體系檢測(cè)原理圖如圖２－２。逡逑Ｉ、＼、逡逑，邋、逡逑Ｚ邐Ｎ逡逑Ｚ邐、逡逑Ｚ邐、逡逑Ｚ邐、逡逑ｙ邐、逡逑ｚ邐、逡逑，ｚ邋ｈｅｘ邐ＢＨＱ２邋ＢＨＱ１邋ＦＡＭ邋Ｃｙ５邋ＢＨＱ２邋ＢＨＱ１邐ＲＯＸ邋、、逡逑ＲＦＰ－Ｐ－１邋＾＾ＲＦＰ－Ｐ－２ａ＾Ｕ＾ＲＦＰ－Ｐ－３ａ＾＾邋ＲＦＰ－Ｐ－４邐ｆｏｒｗａｒｄ邋ｐｒｉｍｅｒ逡逑邐邋Ｉ邋■■姦■邋■邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋■邋Ｉ邋Ｉ邋■邋■邋■邋ＩＩＩ邋■邋■邋Ｉ邋■■邋■邋■邋Ｉ邐＜邋逡逑ｚｚｚｔ邐邋８１邐ｂｐ耐藥決定區(qū)邐邐逡逑———＞逡逑ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｐｒｉｍｅｒ邐霰逡逑ＦＡＭ邐ＨＥＸ邐ＲＯＸ邐Ｃｙ５逡逑ＭＵＴ邋ＷＴ邐ＭＵＴ邋ＷＴ邐ＭＵＴ邋ＷＴ邐ＭＵＴ邋ＷＴ逡逑ｉＪｊｊＭｊＭｉＪＬ逡逑ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＣＣ）邐ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆＣ）邐Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｘ）邐Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（°Ｃ）逡逑圖２－２：檢測(cè)體系探針排布原理圖。四個(gè)通道的探針均根據(jù)野生型設(shè)計(jì)，所以高。值逡逑熔解峰為野生型模版（ＷＴ），低值熔解峰為突變型模版（ＭＵＴ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｐｒｏｂｅ邋ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ．Ｔｈｅ邋ｆｏｕｒ－ｃｈａｎｎｅｌ邋ｐｒｏｂｅｓ逡逑ａｒｅ邋ａｌｌ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ｄｅｓｉｇｎ

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2749218