【摘要】：隨著人們健康觀念的提升,疾病診斷的靈敏性與時(shí)效性變得愈發(fā)重要。即時(shí)診斷技術(shù)Point of care(POCT),指在不受時(shí)間、地點(diǎn)限制的條件下,實(shí)現(xiàn)醫(yī)學(xué)樣本的快速檢測(cè)分析。微流控芯片是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)檢測(cè)的重要工具,利用集成于芯片上的微反應(yīng)器和微檢測(cè)設(shè)備,僅需少量的液體,即可完成相對(duì)快速準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)分析。其中,紙基微流控芯片加工簡(jiǎn)便、成本低廉,可與酶催化顯色反應(yīng)結(jié)合,通過可視化信號(hào)實(shí)現(xiàn)快速診斷,從而擺脫對(duì)專業(yè)儀器的依賴。但是紙芯片的功能相對(duì)單一,研究者希望利用多樣化的材料對(duì)紙芯片進(jìn)行修飾,克服這一限制。酶和探針蛋白的有效固定直接影響紙基生物芯片的性能。而納米材料以其獨(dú)特形貌、催化性能及生物相容性,為提高生物分子的有效固定,構(gòu)建高特異性和高靈敏度的生物芯片提供了新的方向。本文創(chuàng)新性地在紙纖維上原位生長(zhǎng)蛋白-無機(jī)材料雜化物,固定蛋白探針,實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫球蛋白SIgA的檢測(cè)。進(jìn)一步挖掘無機(jī)納米材料的催化性能,將人造酶和天然酶直接組裝到纖維上,實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的快速、靈敏、低成本的檢測(cè)。此外,為了使紙芯片的使用更加簡(jiǎn)便、高效,又研發(fā)了移液器槍頭與紙芯片結(jié)合的裝置用于生物化學(xué)檢測(cè)。本論文的主要研究?jī)?nèi)容如下:1.紙基原位生長(zhǎng)protein G-無機(jī)雜化材料檢測(cè)分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分泌型SIgA(SSIgA)是機(jī)體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分。呼吸道分泌液中SSIgA含量的升高,提示病原體的侵襲。本部分工作結(jié)合protein G能特異性與抗體分子的Fc段結(jié)合的生物學(xué)特性,設(shè)計(jì)了protein G-無機(jī)雜化材料,實(shí)現(xiàn)抗體在紙基芯片的定向固定,提高基于紙基的SSIgA免疫檢測(cè)的靈敏度。本研究通過對(duì)不同類型的紙類基底材料的非特異性吸附對(duì)比,選擇聚酯纖維作為基底材料。隨后將無機(jī)溶液(MnSO_4)和蛋白溶液(protein G)依次滴加到紙類基底材料,原位合成有機(jī)-無機(jī)雜化材料。優(yōu)化protein G的濃度與用量,實(shí)現(xiàn)快速在紙基纖維上原位生長(zhǎng)protein G-無機(jī)雜化材料。通過與試管中液相合成蛋白-無機(jī)雜化材料的方法進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)直接滴加反應(yīng)液到紙基纖維網(wǎng)絡(luò)原位生長(zhǎng)雜化材料可以顯著提高生物分子的利用效率,避免生物分子的浪費(fèi);此外,通過移液管對(duì)液體的精準(zhǔn)操作,為后續(xù)免疫反應(yīng)提高了穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。protein G與抗體Fc段結(jié)合,使抗體結(jié)合的關(guān)鍵部位Fab功能區(qū)面向待檢物加入的方向。并紙為固相基底,進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),檢測(cè)樣品中SSIgA的含量�？梢暬Y(jié)果顯示,肉眼可見的最低SSIgA濃度為1 ng/mL,達(dá)到了基于酶標(biāo)儀分析的ELISA試劑盒的檢測(cè)線�；诘统杀炯埢拿庖叻治龅靡嬗谠簧L(zhǎng)protein G無機(jī)雜化材料,其有效固定的protein G通過抗體的定向固定,為免疫反應(yīng)提供了可進(jìn)行抗原識(shí)別的抗體功能區(qū)(Fab片段)。更為重要的是,基于紙基的靈敏蛋白分析,擺脫了對(duì)專用設(shè)備的依賴,為POCT應(yīng)用打下基礎(chǔ)。2.基于紙基原位生長(zhǎng)酶-Mn_3(PO_4)_2雜化材料用于可視化檢測(cè)葡萄糖錳是一種變價(jià)金屬,研究發(fā)現(xiàn)以錳為基礎(chǔ)的納米材料,可被賦予獨(dú)特的催化活性。在蛋白-無機(jī)雜化材料中,Mn_3(PO_4)_2的功能值得深入挖掘。為了進(jìn)一步探索雜化材料中無機(jī)部分的催化活性,用牛血清蛋白(BSA)合成BSA-Mn_3(PO_4)_2,通過優(yōu)化磷酸根的濃度,獲得具有過氧化物酶活性的BSA-Mn_3(PO_4)_2,展示了蛋白-無機(jī)物雜化材料除了蛋白固定的功能外的另一獨(dú)特性能。以此為基礎(chǔ),在紙基上原位合成了葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOx)-Mn_3(PO_4)_2(GOx-Mn_3(PO_4)_2),通過在Whatman?濾紙上依次滴加0.1M硫酸錳和含有酶的磷酸二氫鉀生成GOx-Mn_3(PO_4)_2雜化材料用于檢測(cè)葡萄糖。通過優(yōu)化酶的濃度和過氧化物酶的底物(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)用量,構(gòu)建了基于酶-Mn_3(PO_4)_2雜化材料的葡萄糖紙基芯片�？疾炝思埢酒撵`敏度、穩(wěn)定性、分析重復(fù)性和特異性等性能,結(jié)果顯示原位生長(zhǎng)酶-Mn_3(PO_4)_2的紙基芯片檢測(cè)葡萄糖時(shí)肉眼可見的最低檢出限為0.1 mM,不僅能特異性的檢測(cè)葡萄糖而且分析重復(fù)率為95%-105%。其靈敏的檢測(cè)得益于原位生長(zhǎng)酶-Mn_3(PO_4)_2雜化物:生物酶(GOx)在氧化生物分子(葡萄糖)的過程中生成過氧化氫(H_2O_2)。后者即刻被雜化物中的Mn_3(PO_4)_2催化還原,并氧化TMB底物。由于酶-Mn_3(PO_4)_2雜化物中,生物酶和擬酶結(jié)合緊密,減少了反應(yīng)中間產(chǎn)物擴(kuò)散的距離,提高了反應(yīng)效率。為了展示其在真實(shí)病理樣品中的運(yùn)用,對(duì)真實(shí)病理血清樣品中的葡萄糖進(jìn)行監(jiān)測(cè),并與商品化的試紙條和葡萄糖儀的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果展示了原位生長(zhǎng)酶無機(jī)雜化材料的紙芯片具有真實(shí)情況下運(yùn)用的潛力。3.結(jié)合紙基微流控芯片和移液槍頭設(shè)計(jì)的快速檢測(cè)裝置即時(shí)診斷中會(huì)涉及到病原物或感染性樣品的檢測(cè),為了避免具有潛在危害的生物污染,檢測(cè)分析盡量在封閉的條件下進(jìn)行。而普通紙基多為開放式,使用時(shí)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)這一問題,本研究將紙基微流控芯片與標(biāo)準(zhǔn)的移液槍頭結(jié)合,建立一個(gè)快速、安全和無污染的檢測(cè)裝置。利用移液槍的吸液過程完成進(jìn)液,三棱柱型的紙芯片放入到移液槍頭的合適位置,實(shí)現(xiàn)3種樣品同時(shí)且互不干擾的檢測(cè)。移液槍頭的吸液過程準(zhǔn)確的將待測(cè)樣品轉(zhuǎn)移到紙帶上,通過可視化的信號(hào)得到檢測(cè)結(jié)果。通過同時(shí)檢測(cè)人工尿液中葡萄糖,蛋白質(zhì)和pH測(cè)定了這種裝置多樣品檢測(cè)的能力。因此該器件制作簡(jiǎn)單,使用方便,可以用于生物和化學(xué)實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：O657;R44
【圖文】：

第 1 章 緒論紙基微流控芯片微流控芯片基微流控芯片的原則是通過前處理將紙纖維分為親水的疏水線之間的區(qū)域作為流動(dòng)通道，流體由于毛細(xì)穿過疏水線，即形成了微流體通道。我們常用的制作有：石蠟打印[44; 45]、噴墨打印[46]、繪圖法、切割法、激網(wǎng)印刷[49]等。光刻法指利用傳統(tǒng)的光刻法完成光刻種各樣的圖案。繪圖法指的是利用繪圖儀在濾紙上形電腦控制的 X-Y Knife Plotter 切割紙或者硝酸纖維膜.1[43]，利用切割法制作了形狀各異的 2D 紙芯片。

圖 1.2 3D 紙基微流控芯片[52; 53]。(I)3D 紙基微流控芯片的圖示。(II)紙基芯片的展開圖示1.2.2 紙基微流控芯片在生物分析中的運(yùn)用紙基微流控芯片可將多個(gè)分析檢測(cè)部分集成于一張紙芯片上。紙芯片具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉和分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，使其廣泛的運(yùn)用于生物分析領(lǐng)域。到目前為此，臨床上尿液、淚液以及血液中多種分析物的檢測(cè)在紙基微流控芯片上成功運(yùn)用。最常見的包括葡萄糖[31; 54; 55]、蛋白質(zhì)[55]、尿酸[56]、乳酸[57]、膽固醇[58]以及免疫分子[59]等。1.2.3 紙基微流控芯片幾種常用的檢測(cè)手段紙基芯片常用的檢測(cè)手段主要有比色檢測(cè)法、電化學(xué)檢測(cè)法、熒光法、電化學(xué)發(fā)光法和基于納米顆粒的檢測(cè)方法等。其中，比色檢測(cè)法、電化學(xué)檢測(cè)法和基于納米顆粒的方法在紙基微流控芯片中最為常用。

圖 1.2 3D 紙基微流控芯片[52; 53]。(I)3D 紙基微流控芯片的圖示。(II)紙基芯片的展開圖示1.2.2 紙基微流控芯片在生物分析中的運(yùn)用紙基微流控芯片可將多個(gè)分析檢測(cè)部分集成于一張紙芯片上。紙芯片具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉和分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，使其廣泛的運(yùn)用于生物分析領(lǐng)域。到目前為此，臨床上尿液、淚液以及血液中多種分析物的檢測(cè)在紙基微流控芯片上成功運(yùn)用。最常見的包括葡萄糖[31; 54; 55]、蛋白質(zhì)[55]、尿酸[56]、乳酸[57]、膽固醇[58]以及免疫分子[59]等。1.2.3 紙基微流控芯片幾種常用的檢測(cè)手段紙基芯片常用的檢測(cè)手段主要有比色檢測(cè)法、電化學(xué)檢測(cè)法、熒光法、電化學(xué)發(fā)光法和基于納米顆粒的檢測(cè)方法等。其中，比色檢測(cè)法、電化學(xué)檢測(cè)法和基于納米顆粒的方法在紙基微流控芯片中最為常用。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2748331