【摘要】：背景與目的:膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)是由于膝關(guān)節(jié)軟骨變性、骨質(zhì)增生而引起的一種慢性骨性關(guān)節(jié)疾患,是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中常見的多發(fā)病,該病在全球的發(fā)病率和致殘率極高,嚴(yán)重影響人類的身心健康。多數(shù)人群的流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)女性KOA的患病率高于男性,女性絕經(jīng)后患病率更明顯高于同齡男性,且其癥狀相對(duì)嚴(yán)重。本研究旨在運(yùn)用iTRAQ標(biāo)記和Nano-HPLC-MS/MS聯(lián)用的技術(shù)分別對(duì)男性及女性KOA血清樣本中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,建立KOA男女性別差異的差異蛋白譜,為探討KOA的發(fā)病機(jī)制、疾病的進(jìn)展和臨床診治的深入研究提供依據(jù)。方法:收集2017年1月至2017年4月在廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院骨科門診就診及住院的男性KOA患者31例,女性KOA患者41例,以及各自同齡對(duì)照的血清樣本各30例。樣本經(jīng)還原、烷基化及Trypsin酶解后,采用iTRAQ標(biāo)記,隨后進(jìn)行Nano-HPLC-MS/MS分析。經(jīng)數(shù)據(jù)搜庫及蛋白定量分析,篩選出男女組中的差異蛋白譜,并對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO分析、KEGG通路分析以及IPA分析等。同時(shí)采用western blot和ELISA驗(yàn)證具有潛在臨床意義的差異蛋白。結(jié)果:KOA患者與正常對(duì)照組共鑒定到571個(gè)蛋白。以質(zhì)譜結(jié)果蛋白比值1.2或0.8,且P-value0.05為差異蛋白的篩選規(guī)則。男性組中,當(dāng)和其正常對(duì)照組相比較時(shí),共有60個(gè)蛋白差異表達(dá)在KOA患者組中,其中上調(diào)的蛋白有50個(gè),下調(diào)的有10個(gè);而在女性組中,相比于其對(duì)照組,共有179個(gè)蛋白差異表達(dá)在KOA患者組中,其中上調(diào)的蛋白有110個(gè),下調(diào)的有69個(gè)。另外,男性組和女性組共同擁有的差異蛋白有38個(gè)。GO分析提示男性組差異蛋白主要參與免疫反應(yīng)、固有免疫應(yīng)答和蛋白水解等生物學(xué)過程;女性組差異蛋白主要參與蛋白水解、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用以及補(bǔ)體激活等生物學(xué)過程。在亞細(xì)胞定位方面,男性及女性組差異蛋白都是主要分布于細(xì)胞外的外泌體,細(xì)胞外區(qū)域及細(xì)胞外間隙等。在分子功能分析時(shí),發(fā)現(xiàn)男性組差異蛋白具有絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、鈣離子結(jié)合等分子功能;女性組差異蛋白主要具有蛋白結(jié)合及絲氨酸型內(nèi)肽酶活性。同時(shí)KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)男性女性組差異蛋白主要參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡,補(bǔ)體和凝集瀑布反應(yīng),吞噬體等通路。此外,女性組差異蛋白還參與焦點(diǎn)粘連,PPAR信號(hào)通路和維生素的消化和吸收等通路。經(jīng)western blot驗(yàn)證,C9、C4B、SAA1在男性KOA中相對(duì)于其對(duì)照組表達(dá)增高;女性組KOA組中,C4B、HSP90α比對(duì)照組表達(dá)增高,而ITIH4的表達(dá)則降低。驗(yàn)證結(jié)果和iTRAQ的趨勢(shì)一致,證明了iTRAQ結(jié)果的可靠性。此外,ELISA結(jié)果表明Ficolin-2在男性及女性KOA組血清中降低,而DEF1在KOA組血清中的水平均增高。結(jié)論:1.通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分別篩選建立了男性和女性KOA組中的差異表達(dá)蛋白譜,這些蛋白質(zhì)分子可以作為潛在的分子標(biāo)志物進(jìn)一步深入研究,將有助于揭示男女KOA的發(fā)病機(jī)制,為研究KOA疾病的進(jìn)展和臨床診治提供理論依據(jù)。2.Ficolin-2和DEF1是男性及女性KOA潛在的診斷生物標(biāo)志物。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R684.3;R446.1
【圖文】：

8圖 1 所示 iTRAQ 試劑的結(jié)構(gòu)以及質(zhì)譜鑒定的原理示意圖Figure 1. The structure of the iTRAQ reagent and the principle of mass spectrometryiTRAQ 試劑由三部分組成：報(bào)告基團(tuán)（reporter group），平衡基團(tuán)（balancegroup），以及肽反應(yīng)標(biāo)記試劑基團(tuán)（peptide reactive group）。其中，報(bào)告基團(tuán)在四標(biāo)iTRAQ試劑中的相對(duì)分子量分別為114Da，115Da，116 Da，117 Da，平衡基團(tuán)相對(duì)分子量分別為 31Da，30Da，29Da，28Da，八標(biāo) iTRAQ 試劑中報(bào)告基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 113Da，114Da，115Da，116Da，117Da，118Da，119Da，121 Da，平衡基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 192Da、191Da、190Da、189Da、188Da、187Da、186Da 和 184Da。在四標(biāo) iTRAQ 試劑中，

以上實(shí)驗(yàn)中涉及樣本的抽取均得到了患者或其家屬的知情同意書，血清樣本的使用已獲得廣西醫(yī)科大學(xué)第九附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意對(duì)每位參與者抽取空腹外周靜脈血 4mL，室溫靜置 30min，4℃ 2000 g心 15min，吸取上層血清并分裝，凍于-80℃冰箱待用。2.2 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線如圖 2，主要包括以下五個(gè)部分：（1）等體積混合 K患者及對(duì)照組各 15 例血清樣本；（2）利用 ProteoMiner Large-Capacity K去除血清中的高豐度蛋白；（3）蛋白酶解及 iTRAQ 標(biāo)記；（4）通Nano-HPLC-MS/MS 鑒定 KOA 血清差異表達(dá)的蛋白，對(duì)差異蛋白進(jìn)行生信息學(xué)分析；（5）部分差異蛋白的表達(dá)驗(yàn)證。

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本文編號(hào)：2741131