【摘要】：背景與目的:膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(KOA)是由于膝關節(jié)軟骨變性、骨質增生而引起的一種慢性骨性關節(jié)疾患,是運動系統(tǒng)中常見的多發(fā)病,該病在全球的發(fā)病率和致殘率極高,嚴重影響人類的身心健康。多數(shù)人群的流行病學調查中發(fā)現(xiàn)女性KOA的患病率高于男性,女性絕經(jīng)后患病率更明顯高于同齡男性,且其癥狀相對嚴重。本研究旨在運用iTRAQ標記和Nano-HPLC-MS/MS聯(lián)用的技術分別對男性及女性KOA血清樣本中差異表達的蛋白質進行分析,建立KOA男女性別差異的差異蛋白譜,為探討KOA的發(fā)病機制、疾病的進展和臨床診治的深入研究提供依據(jù)。方法:收集2017年1月至2017年4月在廣西醫(yī)科大學第九附屬醫(yī)院骨科門診就診及住院的男性KOA患者31例,女性KOA患者41例,以及各自同齡對照的血清樣本各30例。樣本經(jīng)還原、烷基化及Trypsin酶解后,采用iTRAQ標記,隨后進行Nano-HPLC-MS/MS分析。經(jīng)數(shù)據(jù)搜庫及蛋白定量分析,篩選出男女組中的差異蛋白譜,并對差異蛋白進行GO分析、KEGG通路分析以及IPA分析等。同時采用western blot和ELISA驗證具有潛在臨床意義的差異蛋白。結果:KOA患者與正常對照組共鑒定到571個蛋白。以質譜結果蛋白比值1.2或0.8,且P-value0.05為差異蛋白的篩選規(guī)則。男性組中,當和其正常對照組相比較時,共有60個蛋白差異表達在KOA患者組中,其中上調的蛋白有50個,下調的有10個;而在女性組中,相比于其對照組,共有179個蛋白差異表達在KOA患者組中,其中上調的蛋白有110個,下調的有69個。另外,男性組和女性組共同擁有的差異蛋白有38個。GO分析提示男性組差異蛋白主要參與免疫反應、固有免疫應答和蛋白水解等生物學過程;女性組差異蛋白主要參與蛋白水解、受體介導的內吞作用以及補體激活等生物學過程。在亞細胞定位方面,男性及女性組差異蛋白都是主要分布于細胞外的外泌體,細胞外區(qū)域及細胞外間隙等。在分子功能分析時,發(fā)現(xiàn)男性組差異蛋白具有絲氨酸型內肽酶活性、鈣離子結合等分子功能;女性組差異蛋白主要具有蛋白結合及絲氨酸型內肽酶活性。同時KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)男性女性組差異蛋白主要參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡,補體和凝集瀑布反應,吞噬體等通路。此外,女性組差異蛋白還參與焦點粘連,PPAR信號通路和維生素的消化和吸收等通路。經(jīng)western blot驗證,C9、C4B、SAA1在男性KOA中相對于其對照組表達增高;女性組KOA組中,C4B、HSP90α比對照組表達增高,而ITIH4的表達則降低。驗證結果和iTRAQ的趨勢一致,證明了iTRAQ結果的可靠性。此外,ELISA結果表明Ficolin-2在男性及女性KOA組血清中降低,而DEF1在KOA組血清中的水平均增高。結論:1.通過蛋白質組學技術分別篩選建立了男性和女性KOA組中的差異表達蛋白譜,這些蛋白質分子可以作為潛在的分子標志物進一步深入研究,將有助于揭示男女KOA的發(fā)病機制,為研究KOA疾病的進展和臨床診治提供理論依據(jù)。2.Ficolin-2和DEF1是男性及女性KOA潛在的診斷生物標志物。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R684.3;R446.1
【圖文】：

8圖 1 所示 iTRAQ 試劑的結構以及質譜鑒定的原理示意圖Figure 1. The structure of the iTRAQ reagent and the principle of mass spectrometryiTRAQ 試劑由三部分組成：報告基團（reporter group），平衡基團（balancegroup），以及肽反應標記試劑基團（peptide reactive group）。其中，報告基團在四標iTRAQ試劑中的相對分子量分別為114Da，115Da，116 Da，117 Da，平衡基團相對分子量分別為 31Da，30Da，29Da，28Da，八標 iTRAQ 試劑中報告基團的相對分子質量分別為 113Da，114Da，115Da，116Da，117Da，118Da，119Da，121 Da，平衡基團的相對分子質量分別為 192Da、191Da、190Da、189Da、188Da、187Da、186Da 和 184Da。在四標 iTRAQ 試劑中，

以上實驗中涉及樣本的抽取均得到了患者或其家屬的知情同意書，血清樣本的使用已獲得廣西醫(yī)科大學第九附屬醫(yī)院倫理委員會批準同意對每位參與者抽取空腹外周靜脈血 4mL，室溫靜置 30min，4℃ 2000 g心 15min，吸取上層血清并分裝，凍于-80℃冰箱待用。2.2 實驗技術路線實驗技術路線如圖 2，主要包括以下五個部分：（1）等體積混合 K患者及對照組各 15 例血清樣本；（2）利用 ProteoMiner Large-Capacity K去除血清中的高豐度蛋白；（3）蛋白酶解及 iTRAQ 標記；（4）通Nano-HPLC-MS/MS 鑒定 KOA 血清差異表達的蛋白，對差異蛋白進行生信息學分析；（5）部分差異蛋白的表達驗證。

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