【摘要】：目的:研究Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)在膿毒癥中對炎癥反應(yīng)的作用及其對調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)功能活性的影響,并探討其作用機制。方法:1.膿毒癥狀態(tài)下TLR4對小鼠炎癥反應(yīng)的作用:SPF級C57/BL雄性小鼠(Wild type,WT)40只,TLR4基因敲除(TLR4~(-/-))小鼠40只,采用隨機數(shù)字表法隨機分為四組,WT Sham組(n=20),WT CLP組(n=20),TLR4~(-/-)Sham組(n=20),TLR4~(-/-)CLP組(n=20)。小鼠在實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,室溫在24℃左右,濕度在45%左右,每天12h光照維持晝夜循環(huán),自由進食水。術(shù)前12h禁食、4h禁水。CLP組(包括WT CLP組和TLR4~(-/-)CLP組)用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型,Sham組(包括WT Sham組和TLR4~(-/-)Sham組)為假手術(shù)組。觀察術(shù)后小鼠一般狀態(tài)及24h,48h,72h小鼠存活率。健康C57BL6雄性小鼠及同種別TLR4基因敲除小鼠各20只,隨機分為對照組(Sham組)、CLP組、TLR4~(-/-)對照組、TLR4~(-/-)CLP組,各組小鼠10只,重新建立CLP模型。術(shù)后24h斷頸處死存活小鼠,采用蘇木素-伊紅染色觀察肺臟病理學(xué)改變,ELISA檢測小鼠外周血中的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平。2.TLR4在膿毒癥中對Treg功能活性的影響:SPF級C57/BL雄性小鼠(Wild type,WT)40只,TLR基因敲除(TLR4~(-/-))小鼠40只,采用隨機數(shù)字表法隨機分為四組,WT Sham組(n=20),WT CLP組(n=20),TLR4~(-/-)Sham組(n=20),TLR4~(-/-)CLP組(n=20),小鼠在實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,室溫在24℃左右,濕度在40%左右,每天12h光照維持晝夜循環(huán),正常進食水。手術(shù)前12h禁食,4h禁水。CLP組用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥模型,Sham組為假手術(shù)組。術(shù)后24h斷頸處死存活小鼠,實時熒光定量RT-PCR方法檢測各組小鼠脾臟CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細胞內(nèi)Foxp3~+mRNA、TLR4mRNA的表達,流式細胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細胞比例、凋亡率及其Foxp3、CTLA-4、TLR4表達情況,Western blot檢測Treg細胞內(nèi)NF-κB、p65蛋白的表達量;將分離出來的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg細胞與CD4~+CD25~-T細胞共培養(yǎng)24h后,分離上清液,用ELISA檢測上清液中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平。結(jié)果:1.膿毒癥狀態(tài)下TLR4對小鼠炎癥反應(yīng)的影響1.1 WT Sham組及TLR4~(-/-)Sham組小鼠假手術(shù)后,活動較術(shù)前無明顯異常,呼吸如常,正常飲水,大小便如常,對外界刺激反應(yīng)較前無明顯變化。WT CLP組小鼠在手術(shù)后,活動較前明顯減少,嗜睡,呼吸加深加快,被毛凌亂無光澤、豎毛、寒戰(zhàn),飲水進食減少,對外界刺激反應(yīng)差等癥狀,腹腔有積液。TLR4~(-/-)CLP組小鼠手術(shù)后,活動較前減少,呼吸加深加快,被毛凌亂但有光澤,僅部分出現(xiàn)豎毛、寒戰(zhàn),進食減少、飲水正常,對外界刺激反應(yīng)變慢。1.2 WT Sham組及TLR4~(-/-)Sham組小鼠24h、48h、72h內(nèi)小鼠無死亡,72h存活率為100%。WT CLP組小鼠24h、48h、72h存活率分別為80%、50%、40%。TLR4~(-/-)CLP組小鼠24h、48h、72h存活率分別為90%、70%、60%。1.3 Sham組肺臟無明顯異常,WT CLP組較TLR4~(-/-)CLP組肺間質(zhì)明顯增寬,肺組織伴有充血、出血及大量中性粒細胞及巨噬細胞浸潤,同時,血管周圍間隙增大。1.4與Sham組比較,WT CLP組及TLR4~(-/-)CLP組的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平顯著升高(P0.05)。與WT CLP組相比,TLR4~(-/-)CLP組IL-2、TNF-α水平顯著升高(P0.05),IL-4、IL-10的水平則顯著降低(P0.05)。2.膿毒癥狀態(tài)下TLR4對Treg功能及活性的影響2.1 WT CLP組較TLR4~(-/-)CLP組及Sham組Treg細胞CTLA-4、Foxp3表達顯著升高(P0.05),相較于TLR4~(-/-)CLP組及Sham組小鼠,WT CLP組Treg細胞TLR4表達明顯升高。2.2 CLP組較Sham組小鼠脾臟內(nèi)Treg細胞內(nèi)Foxp3mRNA、TLR4mRNA水平明顯升高(P0.05)。TLR4~(-/-)CLP組小鼠較WT CLP組Foxp3mRNA、TLR4mRNA水平顯著降低(P0.05)。2.3 CLP組Treg細胞凋亡較Sham組明顯減少(P0.05);同時,Treg細胞比例顯著高于Sham組(P0.05)。TLR4~(-/-)CLP組Treg細胞凋亡較WT CLP組增多(P0.05),Treg比例明顯降低(P0.05)。2.4 CD4~+CD25~-T細胞與Treg共培養(yǎng)后,相較于與WT CLP組,TLR4~(-/-)CLP組IL-2、TNF-α的水平明顯較高(P0.05),而IL-4、IL-10的水平則顯著降低(P0.05)。2.5 WT CLP組小鼠Treg細胞內(nèi)TLR4、NF-κB、p65的表達水平明顯高于TLR4~(-/-)CLP組及Sham組小鼠(P0.05)。結(jié)論:1.膿毒癥中TLR4基因敲除可減少炎癥因子的分泌,減輕小鼠組織炎癥反應(yīng),減少過度炎癥反應(yīng)對機體造成的損傷,提高存活率。2.膿毒癥中TLR4與Treg細胞功能的異常活化密切相關(guān)。3.該效應(yīng)機制可能與TLR4/NF-κB信號通路影響Treg細胞功能及活性有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7
【圖文】：

各組小鼠術(shù)后生存曲線

圖 2.各組小鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)改變.3.3 小鼠外周血 IL-2、IL-4、IL-10 及 TNF-α 水平如圖 3，與 WT Sham 組相比，TLR4-/-Sham 組小鼠外周血中 IL-2、IL-4、IL-NF-α 水平無明顯差異（P>0.05）。與 WT Sham 組比較，WT CLP 組的 IL-2、IL-10、TNF-α 水平明顯升高（P<0.05）。與 WT CLP 組相比，TLR4-/-CLP 組 ILNF-α 濃度明顯升高（P<0.05），IL-4、IL-10 的濃度則明顯減低（P<0.05）。表 1：各小組小鼠細胞因子水平比較組 TNF-α(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-4(pg/ml) IL-10(pg/ml)T Sham 63.797±10. 436 41.842±9.290 127.014±22.461 56.220±11.634T CLP 297.913±38.123a74.911±11.253a565.247±114.447a149.548±17.936aLR4-/-Sham 82.862±10.344 60.760±11.209 194.069±47.676 47.826±7.497

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 易世杰;趙禮金;;TLR4及其作用的研究進展[J];蛇志;2013年02期

2 申鵬霄;王建生;;雷米普利對阿霉素腎病大鼠腎臟Toll樣受體4,核因子-κB,白細胞介素-8表達的影響[J];中華實用診斷與治療雜志;2010年03期

3 曲冰杰;王宏偉;陸江陽;冀文茹;;改善樹突狀細胞功能干預(yù)性治療膿毒癥的研究進展[J];感染、炎癥、修復(fù);2009年04期

4 司徒超;黃衛(wèi)東;付秀麗;曹翔;;膿毒癥患兒白細胞介素-6、血小板動態(tài)測定的臨床意義[J];中華實用診斷與治療雜志;2009年12期

5 姚詠明，盛志勇;MODS抗炎治療研究的反思[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);1999年08期

6 曹超;馬濤;尤勝義;;調(diào)節(jié)性T細胞在膿毒癥免疫功能障礙的研究進展[J];中華急診醫(yī)學(xué)雜志;2013年11期

7 姚詠明;;免疫功能紊亂在膿毒癥發(fā)病中的作用及意義[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2007年03期

本文編號：2739532