【摘要】：研究背景隨著兒童腫瘤研究的深入和醫(yī)學(xué)技術(shù)水平的發(fā)展,目前兒童腫瘤的五年生存率高達(dá)80%,而放療是治療原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性顱內(nèi)腫瘤及涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白血病和淋巴瘤的有效措施之一。但放療在有效的治療腦部腫瘤的同時(shí)也存在著多種短期和長(zhǎng)期的不良反應(yīng),如認(rèn)知障礙、內(nèi)分泌異常及代謝紊亂等。這些不良反應(yīng)對(duì)患者的生活質(zhì)量造成重大影響,已經(jīng)成為目前腫瘤治療效果評(píng)估中僅次于生存率的重要衡量指標(biāo)。目前尚缺乏針對(duì)放療并發(fā)癥的有效預(yù)防或治療策略。照射后損傷的大腦區(qū)域主要包括以下三方面:1.小腦:小腦被認(rèn)為主要與運(yùn)動(dòng)功能相關(guān),在保持身體平衡和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)方面發(fā)揮重要作用。但目前越來越多的證據(jù)顯示小腦和認(rèn)知功能間同樣存在著重要聯(lián)系,顱腦照射可以引起顯著的小腦蚓部損傷,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。2.下丘腦:臨床回顧分析中顯示高達(dá)80%的幼年期顱腦照射的癌癥幸存者存在著下丘腦-垂體軸功能障礙和代謝并發(fā)癥,其發(fā)病機(jī)制或作用途徑仍不清楚,臨床MRI檢測(cè)顯示下丘腦體積在幼年期照射后會(huì)出現(xiàn)明顯減少。3.海馬:針對(duì)動(dòng)物海馬及室管膜下區(qū)照射會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知與行為功能障礙,我們的研究顯示在照射后海馬區(qū)域存在大量的神經(jīng)干細(xì)胞死亡,臨床相關(guān)研究也顯示海馬照射和認(rèn)知缺陷間存在關(guān)聯(lián)性。因此,本研究將針對(duì)以上三個(gè)腦區(qū)進(jìn)行放射性腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究。最新研究認(rèn)為照射并發(fā)癥發(fā)生的分子機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激、神經(jīng)干/組細(xì)胞死亡、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)血管損傷等。1.照射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng),包括細(xì)胞死亡等;2.神經(jīng)干/組細(xì)胞因其特殊的細(xì)胞周期類型及放射敏感性,是放療引起的主要死亡細(xì)胞類型,研究證實(shí)神經(jīng)干/組細(xì)胞在照射后死亡主要是通過凋亡相關(guān)途徑進(jìn)行,我們之前的研究也證實(shí)減少顱腦照射誘導(dǎo)的神經(jīng)干/組細(xì)胞凋亡,可以有效改善認(rèn)知功能障礙;3.顱腦照射可以引起大腦急性和慢性炎癥反應(yīng),主要以細(xì)胞因子改變、小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及T細(xì)胞浸潤為特征,是導(dǎo)致干細(xì)胞功能障礙和持續(xù)性腦損傷的重要原因;4.血腦屏障異常是照射引起大腦損傷的另一個(gè)重要原因,主要通過血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡及增殖減少來顯著改變血管內(nèi)皮細(xì)胞密度,導(dǎo)致血腦屏障通透性增加和結(jié)構(gòu)異常。作為治療雙向情感障礙疾病的原型藥物-鋰已經(jīng)被證實(shí)具有神經(jīng)保護(hù)作用,可以減少凋亡誘導(dǎo)的神經(jīng)干/組細(xì)胞死亡、拮抗谷氨酸興奮性毒性和減輕成年大腦模型中的短暫性腦缺血發(fā)作,同時(shí)在小鼠顱腦照射前應(yīng)用鋰也顯示出對(duì)認(rèn)知損傷的改善作用。盡管鋰用做治療雙向情感障礙疾病的藥物已有十多年,且在分子、細(xì)胞及行為水平上都已證實(shí)了它的效果,但鋰對(duì)放射性腦損傷的長(zhǎng)期影響以及全身效應(yīng),作用機(jī)制和潛在毒性目前仍不是特別清楚。綜上所述,我們將使用幼年嚙齒動(dòng)物顱腦放射模型研究照射引起的短期和長(zhǎng)期腦損傷,探討顱腦照射引起的常見認(rèn)知障礙、代謝及內(nèi)分泌紊亂等并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制,探索新的預(yù)防和治療藥物,為臨床干預(yù)和治療兒童腫瘤放療并發(fā)癥提供理論依據(jù)和新的策略。第一部分幼年大鼠顱腦照射對(duì)小腦的影響目的顱后窩腫瘤是兒童顱內(nèi)腫瘤最常見的類型,放療是目前最有效的治療方法之一,但是顱內(nèi)照射在有效的治療腫瘤的同時(shí)也會(huì)引起小腦的損傷,進(jìn)而造成短期和長(zhǎng)期的不良反應(yīng),對(duì)患者的生存質(zhì)量產(chǎn)生顯著的影響,該研究的目的是探討幼年大鼠顱腦照射后小腦的病理改變及相關(guān)機(jī)制。方法采用新生11天雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為照射組和對(duì)照組,照射組接受單一劑量6 Gy全腦照射,所有動(dòng)物在照射前給予腹腔5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)注射,對(duì)照射后不同時(shí)間點(diǎn)小腦區(qū)域新生細(xì)胞死亡、增殖和分化進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)檢測(cè)小腦區(qū)域炎癥因子和趨化因子含量、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及血腦屏障改變情況等。結(jié)果1.顱腦照射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要集中在小腦外顆粒層(EGL)區(qū)域,同時(shí)外顆粒層細(xì)胞增殖減少,其中82.9%的新生細(xì)胞在照射后24小時(shí)內(nèi)死亡。2.顱腦照射引起氧化應(yīng)激反應(yīng),小腦區(qū)域出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞聚集和炎癥反應(yīng)增加。3.與其它腦區(qū)相比,顱腦照射引起小腦部位血腦屏障損傷和血流減少更為明顯。4.顱腦照射后16周,小腦體積減少39%,新生細(xì)胞向內(nèi)顆粒層遷移減少87.5%。結(jié)論顱腦照射導(dǎo)致小腦區(qū)域出現(xiàn)持續(xù)的炎癥和損傷,因此,臨床上進(jìn)行兒童腫瘤照射治療時(shí)應(yīng)考慮小腦對(duì)照射的敏感性,進(jìn)一步探討新的保護(hù)策略。第二部分幼年大鼠顱腦照射對(duì)下丘腦的影響目的采用新生11日齡大鼠,通過給予6 Gy全腦照射構(gòu)建幼年期顱腦照射模型,探討顱腦照射對(duì)代謝的影響,探索可的能作用機(jī)制。方法采用新生11天雌性Wistar大鼠,隨機(jī)分為照射組和對(duì)照組,照射組接受單一劑量6 Gy全腦照射。觀察照射后代謝的相關(guān)變化,同時(shí)通過免疫組化、轉(zhuǎn)錄組分析、q PCR和Elisa等技術(shù)手段研究下丘腦、脂肪和肝臟等代謝相關(guān)部位或器官的變化。結(jié)果1.照射后下丘腦區(qū)域出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞死亡、小膠質(zhì)細(xì)胞激活和長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞增值,轉(zhuǎn)錄組分析顯示代謝相關(guān)通路發(fā)生顯著改變。2.顱腦照射組大鼠15周開始出現(xiàn)體重、BMI和腹圍都顯著高于對(duì)照組,同時(shí)照射組出現(xiàn)空腹胰島素水平增加、胰島素抵抗和口服糖耐量異常,血清甘油三酯水平明顯升高等代謝改變。3.顱腦照射組皮下白色脂肪組織、腸系膜白色脂肪組織和性腺白色脂肪組織重量均明顯增加,同時(shí)免疫組化染色顯示白色脂肪組織細(xì)胞肥大增生。結(jié)論對(duì)未成熟腦照射會(huì)導(dǎo)致下丘腦損傷和遲發(fā)性代謝紊亂,考慮到下丘腦區(qū)域在顱腦照射中的易損性,在臨床進(jìn)行顱腦照射應(yīng)考慮對(duì)下丘腦區(qū)域的保護(hù)策略。第三部分幼年大鼠顱腦照射對(duì)海馬的影響及鋰的保護(hù)作用目的顱腦照射是治療原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤及涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白血病及淋巴瘤的最有效方法之一。但是顱腦照射常導(dǎo)致延遲性和進(jìn)行性的認(rèn)知障礙,而且缺乏有效的預(yù)防和治療手段。本研究旨在探索顱腦照射對(duì)海馬區(qū)域的影響和鋰的神經(jīng)保護(hù)作用。方法采用新生11天雄性Wistar大鼠,接受單一劑量6 Gy全腦照射。在照射前后給予腹腔注射鋰鹽進(jìn)行干預(yù),對(duì)照組給予生理鹽水應(yīng)用,檢測(cè)照射后海馬區(qū)域細(xì)胞死亡及增殖情況,以及照射后的長(zhǎng)期行為學(xué)改變及對(duì)內(nèi)分泌激素的影響。結(jié)果1.鋰治療可以有效減少19.8%照射引起的海馬齒狀回顆粒下層神經(jīng)干細(xì)胞死亡,同時(shí)鋰治療后的海馬區(qū)存活的Brd U陽性細(xì)胞總數(shù)相比生理鹽水處理組高50.1%。2.鋰治療減少了照射后60天大鼠在曠場(chǎng)中心區(qū)域停留的時(shí)間,改善了大鼠焦慮行為,同時(shí)物體識(shí)別測(cè)試顯示照射誘導(dǎo)大鼠的記憶功能顯著下降,鋰治療可以有效的改善這種缺陷。3.鋰治療可以恢復(fù)照射導(dǎo)致的遲發(fā)性促甲狀腺激素和生長(zhǎng)激素水平降低,并減少照射損傷引起的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子增加。4.最重要的是,當(dāng)鋰濃度超過12.8m M時(shí),腫瘤細(xì)胞的存活率急劇下降,而對(duì)神經(jīng)干/祖細(xì)胞的影響不明顯。在耐照射的腫瘤DAOY細(xì)胞系中,10Mm的鋰能增加腫瘤細(xì)胞對(duì)照射的敏感性。結(jié)論顱腦照射引起海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡、干細(xì)胞增殖減少及遲發(fā)性的垂體功能減退癥,鋰治療在沒有不良反應(yīng)的同時(shí)有效的減輕了這一系列腦損傷情況,提示鋰治療可以防治放射引起的腦損傷。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R730.55
【圖文】：

第一部分 幼年大鼠顱腦照射對(duì)小腦的影響結(jié)果1 顱腦照射導(dǎo)致小腦皮質(zhì)外顆粒層細(xì)胞死亡TUNEL 染色檢測(cè)小腦區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞死亡情況（圖 1.1A細(xì)胞主要集中在小腦皮質(zhì)外顆粒層（EGL）（圖 1.1A，右圖）。與相比，照射后 6 小時(shí)和 24 小時(shí) TUNEL 標(biāo)記的死亡細(xì)胞總數(shù)均在照射后 6 小時(shí)差異最大（圖 1.1B）�；� H＆E 染色切片，與射后 6 小時(shí)大鼠小腦 EGL 的體積增加 20.8％，而在 24 小時(shí)后EGL 體積反而減少 52.9％（圖 1.1C）。通過免疫印跡確定小腦激活（圖 1.1D），與照射后 24 小時(shí)相比，照射后 6 小時(shí)半胱天3）的 17kDa 降解產(chǎn)物定量顯示 caspase-3 活性增強(qiáng)（圖 1.1E ）。3 活性檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了免疫印跡結(jié)果（圖 1.1F）

小時(shí)與對(duì)照組相比小腦區(qū)域 BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)降低了 82.9％（圖1.2C）。通過 BrdU 和 TUNEL 雙染色（圖 1.2D）定位新生細(xì)胞的凋亡情況，進(jìn)一步通過共焦顯微鏡進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示在對(duì)照組中熒光雙染色細(xì)胞數(shù)目較少，而在照射后 6 小時(shí)和 24 小時(shí)絕大多數(shù) BrdU 陽性染色的細(xì)胞同時(shí)也顯示 TUNEL染色陽性，這表明在照射組中存在大量的新生細(xì)胞凋亡情況（圖 1.2C,E）。圖 1.2 顱腦照射導(dǎo)致小腦新生細(xì)胞死亡。（A）幼年期大鼠小腦中的細(xì)胞層的代表性染色圖片和模式圖。（B）在小腦的 EGL 中代表性的 BrdU 染色。（C）BrdU 陽性細(xì)胞的定量結(jié)果顯示在 6 小時(shí)照射組和對(duì)照組間沒有差異，但是照射后 24 小時(shí)的 BrdU 陽性細(xì)胞數(shù)量減少了 82.9％。（D）在小腦的 EGL 中代表性 BrdU 和 TUNEL 雙染色圖片。（E）BrdU 和 TUNEL 雙陽性細(xì)胞的共聚焦定量分析。對(duì)照組 n = 4，照射組 n = 6。EGL：皮質(zhì)外顆粒層;ML：分子層;PCL：浦肯野細(xì)胞層;IGL：皮質(zhì)內(nèi)顆粒層;WM：白質(zhì)。***P<0.001。3 顱腦照射后小腦小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥反應(yīng)Iba1 標(biāo)記的細(xì)胞（標(biāo)記全部激活和未激活的小膠質(zhì)細(xì)胞）均勻地分布在整個(gè)2 顱腦照射后小腦新生細(xì)胞增殖和死亡

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本文編號(hào)：2733296