【摘要】：背景杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是常見致死性X連鎖隱性遺傳病。臨床上DMD尚無有效治療手段,主要是通過物理治療、糖皮質激素治療、矯形治療等,但都不能延長患者壽命。DMD基因治療是目前治療DMD最有希望的手段之一。DMD基因治療依賴于高效的病毒載體系統(tǒng),其中腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)、腺病毒(adenovirus,AdV)、慢病毒(lentivirus,LV)等在DMD的基因治療研究中廣泛應用。然而,目前國內的病毒包裝技術不成熟,病毒滴度不能達到實驗要求,同時包裝成本高,價格昂貴。因此,建立高效且經(jīng)濟的病毒包裝平臺能更好的促進DMD基因治療研究在臨床中的應用。目前DMD的基因治療研究多采用患者來源的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)作為細胞實驗模型。然而iPSCs獲取效率低,無法避免轉染病毒帶來的潛在風險。近年來,研究發(fā)現(xiàn)羊水來源的間充質干細胞(mesenchymal stem cells derived from amniotic fluid,AFMSC)是羊水干細胞(amniotic fluid-derived stem cells,AFSCs)的一種,其來自產前診斷標本,避免了倫理限制,沒有致瘤性,為DMD基因治療的研究提供新的干細胞來源。因此,本研究在體外建立AAV6,AdV5和LV病毒的包裝體系。同時收集1例DMD患胎來源的羊水,從羊水中分離出AFMSC并完成鑒定。將包裝好的AAV6,AdV5和LV病毒感染AFMSC,觀察三種病毒感染AFMSC的效率,以期建立高效且經(jīng)濟的病毒包裝平臺,為后續(xù)DMD發(fā)病機制和基因治療提供實驗依據(jù)。目的1.建立AAV6,AdV5和LV病毒的包裝體系。2.完成DMD患胎來源的AFMSC的分離與鑒定3.觀察三種病毒感染AFMSC的效率。方法1.體外進行AdV5、AAV6和LV病毒的包裝,并利用實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)完成病毒滴度的測定。2.收集1例DMD基因第10-15外顯子發(fā)生缺失的DMD患胎來源的人羊水樣本,利用直接貼壁法分離出AFMSC,通過細胞形態(tài)、染色體核型分析和流式細胞術(CD34、CD45、CD73、CD105)對AFMSC進行鑒定。3.將三種病毒感染AFMSC,比較感染的效率,評估包裝后病毒的感染能力。結果1.成功完成三種病毒的體外包裝。在三種病毒中,AAV6病毒、AdV5病毒和LV病毒的滴度分別為1.890×10~(13)vg/mL、1.280×10~8 vg/mL和1.252×10~(11)vg/mL。2.從DMD患胎來源的羊水樣本中成功分離出AFMSC。AFMSC呈梭形或長梭形,單層生長,旋渦樣排列。染色體核型分析表明AFMSC為正常核型。流式細胞術檢測表明AFMSC表面標志物CD34和CD45為陰性,CD73和CD105為陽性。3.三種病毒均成功感染AFMSC。在感染效率上,AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。結論本實驗在體外完成AdV5、AAV6和LV病毒的包裝。同時也從DMD患胎來源的羊水樣本中成功分離出AFMSC并完成鑒定。體外包裝的三種病毒均能成功感染AFMSC,其中AdV5病毒的感染效率最高,LV病毒其次,AAV6病毒感染效率最低。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R746.4;R450
【圖文】：

圖 2 AAV6 病毒轉染 HEK-293 細胞 24h、48h 和 72h 的情況（100×）A：AAV6 病毒轉染HEK-293 細胞 24h 的細胞形態(tài)圖；B ：AAV6 病毒轉染 HEK-293 細胞 48h 的細胞形態(tài)圖；C：AAV6 病毒轉染 HEK-293 細胞 72h 的細胞形態(tài)圖；D：AAV6 病毒轉染 HEK-293 細胞24h 的熒光圖；E：AAV6 病毒轉染 HEK-293 細胞 48h 的熒光圖；F：AAV6 病毒轉染 HEK-29細胞 72h 的熒光圖。

羊水標本DMD基因MLPA檢測結果

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本文編號：2730377