【摘要】：凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,由凝血酶原在Xa因子作用下轉化而來,將纖維蛋白原轉換為纖維蛋白,在凝血級聯機制中有著重要的作用。研究表明,凝血酶能夠加快靜脈血栓栓塞、腎病的進程以及參與中樞神經系統疾病等多種疾病的發(fā)生,其濃度的改變會導致功能的轉變。因此,定量檢測復雜生物樣品中的凝血酶含量對臨床研究和早期診斷有重要的意義。本研究結合適配體技術、納米技術與鉛離子依賴性DNA酶輔助的信號放大技術,提出了一種無酶、無標記、高靈敏度的磁控電化學適體傳感器用于凝血酶的檢測。本研究基于磁性生物復合材料和鉛離子依賴性DNA酶,構建電化學傳感平臺用于凝血酶的檢測。分別使用了三條核苷酸鏈S1、S2和S3,其中互補鏈S1包含巰基末端、凝血酶適配體互補序列以及鉛離子(Pb~(2+))依賴性DNA酶酶切部位,S2為凝血酶適配體序列,S3是Pb~(2+)依賴性DNA酶序列。由于亞甲藍帶有正電荷,它能夠通過靜電作用吸附到帶負電DNA上,可作為電化學信號分子。以磁性Fe_3O_4@Au納米粒(Fe_3O_4@Au NPs)為載體,S1通過Au-S鍵固定在納米粒表面,互補雜交S2,獲得磁性生物復合材料Fe_3O_4@Au-S1/S2 NPs。當目標物凝血酶存在時,凝血酶競爭結合S2,從而S1上Pb~(2+)依賴性DNA酶酶切部位暴露出來,加入S3和Pb~(2+)后,S1被切割,少量的亞甲藍被吸附到DNA鏈上。當凝血酶不存在時,S1/S2雜交雙鏈不被破壞,下游反應無法繼續(xù)進行,S1/S2雜交雙鏈能吸附大量的亞甲藍。最終,待測的納米復合物利用磁場誘導自組裝將在磁性玻碳電極表面形成磁性軟膜,通過差示脈沖伏安法(Different pulse voltammetry,DPV)檢測亞甲藍的電信號變化,實現了待測物凝血酶與亞甲藍電化學響應之間的轉化與檢測。本研究構建的電化學適體傳感器中,適配體能夠特異性識別凝血酶;Pb~(2+)依賴性DNA酶的酶切作用明顯增加了Fe_3O_4@Au NPs表面核酸的變量,使得亞甲藍的電信號變量增加了3倍,使靈敏度顯著增加;磁性納米材料的引入不僅方便磁性分離,而且可以通過磁場誘導自組裝在磁性玻碳電極表面形成磁性軟膜而產生測定信號,完成測定后,取出磁性電極中的磁芯,磁性軟膜便可從電極表面脫落,增強了電極再生和重復使用性能,另外,利用納米材料大的表面積達到豐富的核酸固載。該電化學適體傳感器對凝血酶定量檢測的線性范圍為5-5000 pmol L~(-1),檢測限低至1.8 pmol L~(-1),可以用于血清中凝血酶的靶向檢測。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R446.1
【圖文】：

南京醫(yī)科大學碩士學位論文其中互補鏈 S1 包含三個功能區(qū)：5'巰基末端、Pb2+依賴性 DNA 酶的底物鏈序列以及凝血酶適配體的互補序列，S2 為凝血酶適配體序列，S3 是 Pb2+依賴性DNA 酶序列。采用 Fe3O4@Au NPs 作為載體，可以實現實驗過程中快速磁性分離和待測的納米復合物通過磁場誘導自組裝到電極表面，通過 Au-S 鍵將 S1 的5'端固定以獲得了 Fe3O4@Au-S1 復合納米材料。加入 MCH 溶液中，MCH 可以起到封閉劑的作用，占據 Fe3O4@Au NPs 表面剩余位點，去除 S1 的非特異性吸附。S2 與 S1 的凝血酶適配體的互補序列雜交互補，在 Fe3O4@Au NPs 表面形成雙鏈結構（dsDNA）。

DNA 酶的底物鏈序列功能區(qū)，S3 無法切割 dsDNA 中的 S1。泳道 8 中 dsDNA條帶比泳道 7 弱，表明在溶液中加入凝血酶后，凝血酶競爭結合 S2，完全暴露的 S1 被 S3 切割，使得 dsDNA 減少，電泳條帶變淺。經電泳結果證實，目標物凝血酶介導啟動 S3 的酶切作用，與預期設想一致�？疾� S3 輔助的信號放大，比較反應體系在 Pb2+依賴性 DNA 酶作用前后電化學信號的變化。向磁性生物復合材料 Fe3O4@Au-S1/S2 NPs 中加入不同濃度的凝血酶溶液，相同的凝血酶濃度下，一份不加S3和Pb2+，一份加入S3和Pb2+，最終記錄磁性材料表面吸附的亞甲藍電化學信號的下降值ΔI，比較其在 S3 作用下（紅色）和不加入 S3 時（黑色）ΔI 的變化。如圖 2（B）所示，在加入相同濃度的凝血酶的條件下，Pb2+依賴性DNA酶作用后的ΔI比未處理的高3倍。因此，Pb2+依賴性 DNA 酶切割 S1，導致 Fe3O4@Au NPs 表面 DNA 的量明顯減少，吸附的亞甲藍減少，ΔI 成倍增加，實現了基于 S3 輔助的信號放大，提高了該方法的靈敏度。

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張何;王青;傅昕;趙智糧;;基于滾環(huán)擴增及串聯G-四鏈體-血紅素DNA酶的高靈敏“Turn-on”型Hg~(2+)傳感器研究[J];分析化學;2018年10期

2 高曉霞;賈玉華;楊金鳳;李繼山;楊榮華;;核酸酶催化放大傳感體系的設計及其在鉛離子比色檢測中的應用[J];分析化學;2013年05期

3 劉程偉;張雪松;王石;田浩;程明勛;王樹卿;胡新華;張強;辛世杰;段志泉;;Egr-1DNA酶抑制自體移植靜脈內膜增生的實驗研究[J];中國普外基礎與臨床雜志;2011年10期

4 王彬;夏焦兵;;高中生物學中與DNA有關的6類酶[J];生物學通報;2013年01期

5 高艾;王玉茹;何錫文;尹學博;;聚多巴胺包埋G-四聯體/血紅素DNA酶制備過氧化氫生物傳感器[J];分析化學;2012年10期

6 王波,陳梅紅;反義技術研究進展[J];中國生物工程雜志;2004年12期

7 付文;蔡林芳;郭志慧;鄭行望;;DNAzyme聚乙烯吡咯烷酮/Ru(bpy)_3~(2+)/SiO_2納米粒子相互作用及鉛(Ⅱ)的電化學發(fā)光分析方法研究[J];陜西師范大學學報(自然科學版);2017年02期

8 王敏娟;;DNA酶傳感器的研究進展[J];化學與生物工程;2013年06期

9 劉程偉;張雪松;王石;王樹卿;田浩;程明勛;胡新華;辛世杰;段志泉;;納米粒子介導Egr-1 DNA酶轉染抑制移植靜脈內膜增生[J];中國組織工程研究;2012年08期

10 鄭錦輝,王峰,�？∑�;10-23DNA酶體外切割HBV前C/C區(qū)mRNA的初步研究[J];臨床肝膽病雜志;2002年06期

相關會議論文 前9條

1 江婧婧;林欣怡;刁國旺;;基于Mg~(2+)-DNA酶催化裂解反應與β-CDP主客體作用調控的無酶電化學DNA傳感研究[A];第十三屆全國電分析化學學術會議會議論文摘要集[C];2017年

2 唐子圣;張靈;漆正楠;夏文君;王易維;魯娜;;基于DNA酶和無機酶級聯信號放大策略的變異鏈球菌檢測研究[A];中華口腔醫(yī)學會第十一次全國牙體牙髓病學學術大會論文匯編[C];2018年

3 劉云清;李小雨;楊瑞英;張小華;陳金華;;基于TdT酶輔助血晶素/G四聯體DNA酶納米線的堿性磷酸酶活性電化學檢測[A];第十三屆全國電分析化學學術會議會議論文摘要集[C];2017年

4 梁剛;滿燕;潘立剛;;基于G-DNAzyme對2-羥基芴的電化學傳感檢測研究[A];中國化學會第30屆學術年會摘要集-第四分會：生物分析和生物傳感[C];2016年

5 周慧;吳志芳;陳慧芳;李勛;;銨離子對G-四鏈體-血紅素DNA酶催化ABTS顯色反應的影響[A];第十三屆全國電分析化學學術會議會議論文摘要集[C];2017年

6 何智梅;朱俊杰;;基于DNAzyme的多功能納米器件用于基因調控和可控藥物釋放[A];中國化學會第30屆學術年會摘要集-第三分會：納米傳感新原理新方法[C];2016年

7 姜交來;云雯;蔡定洲;王少飛;杜云峰;桑革;廖俊生;;超靈敏放射性UO_2~(2+)生物傳感器的設計[A];中國化學會第30屆學術年會摘要集-第十四分會：核化學與放射化學[C];2016年

8 唐卓;;體外篩選能夠剪切DNA的DNAzyme[A];中國化學會第29屆學術年會摘要集——第22分會：化學生物學[C];2014年

9 蔣剛鋒;趙海旭;翁金鵬;馬琪;張輝;劉明哲;;DNA酶交聯水凝膠的制備及其在過氧化氫檢測方面的應用[A];2015年全國高分子學術論文報告會論文摘要集——主題B 生物大分子[C];2015年

相關博士學位論文 前4條

1 郭悅華;基于DNA組裝的檢測方法與DNA酶活性研究[D];南京大學;2017年

2 魯娜;基于功能核酸組裝結構的腺苷和汞離子傳感器研究[D];中國科學技術大學;2009年

3 胡蓉;基于功能核酸的納米組裝與生物傳感的新方法研究[D];湖南大學;2014年

4 趙旭華;基于DNA酶和氧化石墨烯的高靈敏熒光生物傳感體系的研究[D];湖南大學;2013年

相關碩士學位論文 前10條

1 朱春紅;基于鉛離子依賴性DNA酶構建磁控誘導電化學適體傳感器及血清凝血酶的檢測[D];南京醫(yī)科大學;2019年

2 蔣如劍;基于鈰離子絡合物用于抗細菌粘附模擬DNA酶的構建[D];煙臺大學;2018年

3 莫菲;基于DNA納米蝎的腫瘤細胞內基因沉默新方法研究[D];重慶醫(yī)科大學;2018年

4 程艷;量子點電致化學發(fā)光共振能量轉移及其分析應用[D];南京大學;2014年

5 曹金秀;基于核酸酶的高靈敏度和高選擇性的鈾的生物傳感方法研究[D];南華大學;2015年

6 丁興華;基于碳納米管技術的快速檢測病原菌方法的研究[D];湖南師范大學;2011年

7 孫曉豐;信號放大方法在細胞中生物活性小分子檢測中的應用研究[D];青島科技大學;2014年

8 宋麗芳;基于DNA酶增敏的微流控化學發(fā)光法在生物分析中的應用研究[D];浙江大學;2014年

9 朱丹;基于核酸適體的新型DNA酶納米蛋白質傳感器的構建及應用研究[D];華東師范大學;2012年

10 付玲;沙雷氏菌FS14（Serratia sp.FS14）中兩種分泌蛋白的分離純化及相關特性的研究[D];南京農業(yè)大學;2011年

本文編號：2728888