【摘要】：凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶,由凝血酶原在Xa因子作用下轉(zhuǎn)化而來(lái),將纖維蛋白原轉(zhuǎn)換為纖維蛋白,在凝血級(jí)聯(lián)機(jī)制中有著重要的作用。研究表明,凝血酶能夠加快靜脈血栓栓塞、腎病的進(jìn)程以及參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的發(fā)生,其濃度的改變會(huì)導(dǎo)致功能的轉(zhuǎn)變。因此,定量檢測(cè)復(fù)雜生物樣品中的凝血酶含量對(duì)臨床研究和早期診斷有重要的意義。本研究結(jié)合適配體技術(shù)、納米技術(shù)與鉛離子依賴性DNA酶輔助的信號(hào)放大技術(shù),提出了一種無(wú)酶、無(wú)標(biāo)記、高靈敏度的磁控電化學(xué)適體傳感器用于凝血酶的檢測(cè)。本研究基于磁性生物復(fù)合材料和鉛離子依賴性DNA酶,構(gòu)建電化學(xué)傳感平臺(tái)用于凝血酶的檢測(cè)。分別使用了三條核苷酸鏈S1、S2和S3,其中互補(bǔ)鏈S1包含巰基末端、凝血酶適配體互補(bǔ)序列以及鉛離子(Pb~(2+))依賴性DNA酶酶切部位,S2為凝血酶適配體序列,S3是Pb~(2+)依賴性DNA酶序列。由于亞甲藍(lán)帶有正電荷,它能夠通過(guò)靜電作用吸附到帶負(fù)電DNA上,可作為電化學(xué)信號(hào)分子。以磁性Fe_3O_4@Au納米粒(Fe_3O_4@Au NPs)為載體,S1通過(guò)Au-S鍵固定在納米粒表面,互補(bǔ)雜交S2,獲得磁性生物復(fù)合材料Fe_3O_4@Au-S1/S2 NPs。當(dāng)目標(biāo)物凝血酶存在時(shí),凝血酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合S2,從而S1上Pb~(2+)依賴性DNA酶酶切部位暴露出來(lái),加入S3和Pb~(2+)后,S1被切割,少量的亞甲藍(lán)被吸附到DNA鏈上。當(dāng)凝血酶不存在時(shí),S1/S2雜交雙鏈不被破壞,下游反應(yīng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行,S1/S2雜交雙鏈能吸附大量的亞甲藍(lán)。最終,待測(cè)的納米復(fù)合物利用磁場(chǎng)誘導(dǎo)自組裝將在磁性玻碳電極表面形成磁性軟膜,通過(guò)差示脈沖伏安法(Different pulse voltammetry,DPV)檢測(cè)亞甲藍(lán)的電信號(hào)變化,實(shí)現(xiàn)了待測(cè)物凝血酶與亞甲藍(lán)電化學(xué)響應(yīng)之間的轉(zhuǎn)化與檢測(cè)。本研究構(gòu)建的電化學(xué)適體傳感器中,適配體能夠特異性識(shí)別凝血酶;Pb~(2+)依賴性DNA酶的酶切作用明顯增加了Fe_3O_4@Au NPs表面核酸的變量,使得亞甲藍(lán)的電信號(hào)變量增加了3倍,使靈敏度顯著增加;磁性納米材料的引入不僅方便磁性分離,而且可以通過(guò)磁場(chǎng)誘導(dǎo)自組裝在磁性玻碳電極表面形成磁性軟膜而產(chǎn)生測(cè)定信號(hào),完成測(cè)定后,取出磁性電極中的磁芯,磁性軟膜便可從電極表面脫落,增強(qiáng)了電極再生和重復(fù)使用性能,另外,利用納米材料大的表面積達(dá)到豐富的核酸固載。該電化學(xué)適體傳感器對(duì)凝血酶定量檢測(cè)的線性范圍為5-5000 pmol L~(-1),檢測(cè)限低至1.8 pmol L~(-1),可以用于血清中凝血酶的靶向檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R446.1
【圖文】：

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文其中互補(bǔ)鏈 S1 包含三個(gè)功能區(qū)：5'巰基末端、Pb2+依賴性 DNA 酶的底物鏈序列以及凝血酶適配體的互補(bǔ)序列，S2 為凝血酶適配體序列，S3 是 Pb2+依賴性DNA 酶序列。采用 Fe3O4@Au NPs 作為載體，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中快速磁性分離和待測(cè)的納米復(fù)合物通過(guò)磁場(chǎng)誘導(dǎo)自組裝到電極表面，通過(guò) Au-S 鍵將 S1 的5'端固定以獲得了 Fe3O4@Au-S1 復(fù)合納米材料。加入 MCH 溶液中，MCH 可以起到封閉劑的作用，占據(jù) Fe3O4@Au NPs 表面剩余位點(diǎn)，去除 S1 的非特異性吸附。S2 與 S1 的凝血酶適配體的互補(bǔ)序列雜交互補(bǔ)，在 Fe3O4@Au NPs 表面形成雙鏈結(jié)構(gòu)（dsDNA）。

DNA 酶的底物鏈序列功能區(qū)，S3 無(wú)法切割 dsDNA 中的 S1。泳道 8 中 dsDNA條帶比泳道 7 弱，表明在溶液中加入凝血酶后，凝血酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 S2，完全暴露的 S1 被 S3 切割，使得 dsDNA 減少，電泳條帶變淺。經(jīng)電泳結(jié)果證實(shí)，目標(biāo)物凝血酶介導(dǎo)啟動(dòng) S3 的酶切作用，與預(yù)期設(shè)想一致�？疾� S3 輔助的信號(hào)放大，比較反應(yīng)體系在 Pb2+依賴性 DNA 酶作用前后電化學(xué)信號(hào)的變化。向磁性生物復(fù)合材料 Fe3O4@Au-S1/S2 NPs 中加入不同濃度的凝血酶溶液，相同的凝血酶濃度下，一份不加S3和Pb2+，一份加入S3和Pb2+，最終記錄磁性材料表面吸附的亞甲藍(lán)電化學(xué)信號(hào)的下降值ΔI，比較其在 S3 作用下（紅色）和不加入 S3 時(shí)（黑色）ΔI 的變化。如圖 2（B）所示，在加入相同濃度的凝血酶的條件下，Pb2+依賴性DNA酶作用后的ΔI比未處理的高3倍。因此，Pb2+依賴性 DNA 酶切割 S1，導(dǎo)致 Fe3O4@Au NPs 表面 DNA 的量明顯減少，吸附的亞甲藍(lán)減少，ΔI 成倍增加，實(shí)現(xiàn)了基于 S3 輔助的信號(hào)放大，提高了該方法的靈敏度。

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本文編號(hào)：2728888