【摘要】：目的:研究不同人群分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)的耐藥譜、CRE菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥機制及其對磷霉素耐藥的主要機制,應(yīng)用MALDI-TOF建立產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的快速檢測方法,為臨床的合理用藥及醫(yī)院感染的防控提供幫助。方法:1.收集我院2015年1月-2017年12月臨床分離的CRE菌株,使用全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)藥物的體外藥敏實驗,用紙片擴散法(K-B)檢測頭孢哌酮/舒巴坦和替加環(huán)素、瓊脂稀釋法檢測磷霉素的體外藥敏實驗。2.對227株CRE(其中166株肺炎克雷伯菌,29株大腸埃希菌,32株陰溝腸桿菌)進(jìn)行PCR擴增耐藥基因(包括碳青霉烯酶基因、ESBLs基因、AmpC基因及fos基因)和改良碳青霉烯酶滅活試驗(mCIM)和EDTA抑制的碳青霉烯酶滅活試驗(eCIM)。用脈沖場凝膠電泳試驗(PFGE)檢測CRKP菌株的DNA指紋圖譜,分析菌株的同源性。3.對fos基因陽性菌株進(jìn)行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗。對fos基因陰性的磷霉素耐藥菌株進(jìn)行碳源生長試驗、用PCR擴增和測序技術(shù)對靶酶基因、轉(zhuǎn)運體相關(guān)基因進(jìn)行檢測和比對分析;4.收集我院2018年1月-2018年6月臨床分離的74株CSKP和前面收集的102株CPKP做質(zhì)譜儀自建模型,利用MALDI-TOF質(zhì)譜儀和ClinProTools3.0軟件建立CPKP和CSKP的篩選模型,用于臨床產(chǎn)酶菌株的快速篩查;5.將CPKP菌株分別與不同濃度的亞胺培南和美羅培南共孵育,用MALDI-TOF檢測不同時間段內(nèi)菌株對底物水解情況,摸索最佳條件。結(jié)果:1.我院三年間共檢出272株CRE,主要分離自痰液,其中成人組標(biāo)本類型前三位的是痰液、尿液和血液(分別占62.96%、20.83%和6.94%),兒童組前三位則是痰液、血液和尿液(分別占50.00%、30.36%和10.71%);成人CRE菌株主要來源于ICU(占40.82%)和神經(jīng)外科(占13.43%)),兒童CRE菌株則主要來源于新生兒科(占30.35%)和呼吸內(nèi)科(占17.86%)。CRE菌株對單環(huán)內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物等抗菌藥物均表現(xiàn)出高度耐藥性,但成人組和兒童組對于氟喹諾酮類藥物和氨基糖苷類藥物的耐藥率存在顯著性差異,成人組耐藥率基本在60%以上(僅阿米卡星為40.8%),兒童組基本在40%以下。2.227株CRE菌株中mCIM實驗陽性193株,陽性率85.0%,其中eCIM實驗陽性率30.4%;碳青霉烯酶基因的陽性率為83.7%(190/227),其中146株攜帶bla_(KPC-2),47株攜帶bla_(NDM-1),43株攜帶bla_(IMP-4),有14.5%的菌株同時攜帶兩種碳青霉烯酶基因;87.2%的菌株攜帶ESBLs基因,以bla_(TEM),bla_(SHV)和bla_(CTX-M-14)為主;11.0%的菌株攜帶AmpC酶基因;共有76.2%的菌株同時攜帶碳青霉烯酶基因及其他耐藥基因(ESBLs,AmpC酶基因)。部分菌株的PFGE電泳和同源性結(jié)果分析顯示菌株間親緣距離在0.8以下,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),同源性較低。3.227株CRE中有86株磷霉素耐藥,耐藥率37.9%,其中成人組75株耐藥(耐藥率41.2%),兒童組11株(耐藥率18.9%);86株磷霉素耐藥株中75株檢出fos基因(均為fosA3),其中25株質(zhì)粒結(jié)合成功,表明fosA3基因可通過可移動元件水平傳播;11株(2株陰溝腸桿菌,9株肺炎克雷伯菌)未檢測出fos基因;4.11株fos基因陰性菌株的磷酸己糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(UhpT)功能正常。2株肺炎克雷伯菌的甘油-3-磷酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(GlpT)功能正常,其余9株GlpT系統(tǒng)可能存在功能障礙。2株陰溝腸桿菌均未擴增出MurA靶酶基因;9株肺炎克雷伯菌中有6株MurA序列無突變,1株MurA序列存在單核苷酸插入,導(dǎo)致移碼突變,提前終止翻譯,還有2株MurA序列存在氨基酸替換現(xiàn)象。在glpT基因序列分析中發(fā)現(xiàn)3株肺炎克雷伯菌該序列無改變,1株肺炎克雷伯菌的glpT基因中間存在插入一段IS5的序列,其他菌株的序列擴增失敗。pstI序列擴增分析發(fā)現(xiàn)存在較多的位點缺失突變或存在單核苷酸插入,致翻譯提前終止。11株菌的uhpT,uhpA和cyaA基因檢測均未發(fā)現(xiàn)突變。5.MALDI-TOF上建立的篩選模型在兩組細(xì)菌間發(fā)現(xiàn)5個差異蛋白峰,驗證實驗顯示對CPKP分組的準(zhǔn)確性為88.46%,對CSKP分組的準(zhǔn)確性為72.5%;水解底物法實驗中亞胺培南濃度為0.5g/L時,孵育30min組CPKP水解亞胺培南的水解率達(dá)98.61%,1h組水解率為100%;美羅培南濃度2mM孵育2h組水解率為90.28%,3h組和4h組均為91.67%;結(jié)論:1.CRE菌株對常用抗菌藥物呈現(xiàn)高度耐藥,來源于成人組和兒童組的分離株在氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率上存在顯著性差異,兒童組的菌株更敏感。CRE菌株對磷霉素和替加環(huán)素的耐藥率較低,臨床可以根據(jù)感染個體具體情況及藥物適應(yīng)癥綜合考慮,作為經(jīng)驗用藥的備選藥物。2.CRE菌株多同時攜帶多種耐藥基因,其中碳青霉烯酶基因以bla_(KPC-2)為主,其次為bla_(NDM-1)和bla_(IMP-4)。部分CRKP集中分離科室的菌株間親緣關(guān)系較遠(yuǎn),同源性較低,尚未發(fā)現(xiàn)克隆傳播現(xiàn)象。3.攜帶fosA3基因是我院CRE菌株對磷霉素耐藥的主要原因,且fosA3基因可通過可移動元件水平傳播;4.fos基因陰性CRE菌株多存在靶酶改變和轉(zhuǎn)運體功能障礙,其中陰溝腸桿菌存在靶酶缺失或構(gòu)像改變,肺炎克雷伯菌主要是glpT基因序列缺失和插入突變。但對于個別氨基酸突變是否導(dǎo)致靶酶改變、GlpT轉(zhuǎn)運系統(tǒng)相關(guān)蛋白改變與磷霉素耐藥之間關(guān)系需進(jìn)一步分析。5.基于MALDI-TOF MS建立的兩種快速篩查方法中,自建模型法對CPKP的敏感性較好,對CSKP的區(qū)分有一定的假陽性;兩種底物的水解酶法比較發(fā)現(xiàn),0.5g/L亞胺培南孵育30min的實驗方案更適合臨床應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5
【圖文】：

圖 1-1 216 株成人 CRE 菌株科室分布情況Fig.1-1 Distribution of clinical departments of 216 CRE strains from adult兒童組 CRE 菌株主要來源于新生兒科、兒童呼吸內(nèi)科、PICU、胸外 ICU、消化內(nèi)科等（詳見圖 1-2）。

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文分離的陰溝腸桿菌對這兩類藥物的耐藥性明顯的高于兒童，除阿米卡星耐藥率為17.3%外，其他基本在 40%以上；成人與兒童對于大腸埃希菌的氟喹諾酮和氨基糖苷類藥物的耐藥情況同陰溝腸桿菌類似，但是相比之下大腸埃希菌對這兩種藥的耐藥率明顯較高。兒童大腸埃希菌（62.7%）對于替卡西林/克拉維酸復(fù)合制劑的耐藥性明顯強于成人大腸埃希菌（94.7%）。對復(fù)方新諾明的耐藥率，成人與兒童的陰溝腸桿菌相似，分別為 47.4%和 44.4%；成人肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對于復(fù)方新諾明的耐藥率明顯高于兒童（表 1-12）。無論是成人 CRE 還是兒童 CRE，甚至不同菌種的細(xì)菌（肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌）對于替加環(huán)素的敏感性均較高，幾乎 100% 敏感。對于頭孢哌酮/舒巴坦，兒童 CRE 和成人 CRE的耐藥率均較高。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 程躍;梅清;李家斌;;磷霉素耐藥機制研究進(jìn)展[J];安徽醫(yī)學(xué);2014年11期

本文編號：2728453