【摘要】：研究目的:為滿足臨床快速診斷病原菌的需求,解決微流控芯片制作工藝繁雜等問題,本研究采用微細加工技術(shù),以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsioxane,PDMS)制作蓋片,以玻璃制作基片,構(gòu)建一種設(shè)計簡單、制作方便、用于病原菌快速檢測和有自主知識產(chǎn)權(quán)的磁免疫微流控芯片。應(yīng)用于細菌性腦膜炎病原菌早期鑒別,提升我國地區(qū)不同規(guī)模醫(yī)院、衛(wèi)生所和疾控中心的檢測能力。研究方法1.設(shè)計制作磁免疫微流控芯片和建立芯片檢測系統(tǒng):本研究采用計算機軟件(AutoCAD 2008 Simplified Chinese)設(shè)計磁免疫微流控芯片CAD圖形,以光刻機、勻膠機、PDMS混合儀和等離子清洗機等儀器制作芯片,以聚二甲基硅氧烷和玻片為主要材料構(gòu)建3層結(jié)構(gòu)微流控芯片。制備的磁免疫微流控芯片與注射器、進樣管和出樣管連接,結(jié)合微量注射泵、熒光倒置顯微鏡和高速攝像熒光CCD等儀器,建立磁免疫微流控芯片捕獲檢測系統(tǒng)。2.修飾免疫磁珠和優(yōu)化捕獲檢測條件:磁免疫微流控芯片以免疫磁珠為固定相,在芯片外批量修飾磁珠,以外部磁場固定磁珠位置,結(jié)合生物素-親和素放大作用和抗原抗體特異性反應(yīng)等特點,選擇最優(yōu)進樣速度、檢測時間和熒光染料等實驗參數(shù),以最佳檢測條件鑒定病原菌。3.磁免疫微流控芯片檢測肺炎鏈球菌:以磁免疫微流控芯片為檢測平臺,以最佳檢測條件進樣捕獲,以免疫熒光技術(shù)為檢測方法,驗證芯片可用性、捕獲率、特異性、靈敏度和可重復(fù)性等參數(shù),并模擬檢測臨床標本中肺炎鏈球菌。研究結(jié)果1.以PDMS和玻片成功構(gòu)建3層結(jié)構(gòu)磁免疫微流控芯片,包括檢測芯片層、玻片層和磁場固定芯片層。上層檢測芯片包括進樣口、進樣通道、檢測室、出樣通道和出樣口;中層玻片為封接基片,和上層PDMS蓋片等離子清洗后不可逆封接;下層磁場固定芯片填充磁鐵,磁鐵位置對應(yīng)檢測芯片捕獲室,磁場固定芯片和玻璃基片可逆封接,方便磁場重復(fù)使用。2.設(shè)置注射泵進樣速度1μL/min、5μL/min、10μL/min和15μL/min,分別注入相同濃度肺炎鏈球菌菌懸液,收集出樣口廢液,計算芯片捕獲率都高于95%。3.分別檢測濃度1.5×10~1 CFU/mL~1.5×10~5 CFU/mL的大腸埃希菌ATCC25922,計算芯片捕獲率都為0。4.同濃度菌懸液用不同工作濃度的AO染色液和碧云天公司配制的Hoechst33342染色液避光染色1h后分別注入磁免疫微流控芯片,在倒置熒光顯微鏡下觀察,用高速攝像CCD拍攝。結(jié)果顯示AO染色液背景熒光較深,影響鏡下觀察檢測;Hoechst 33342染色液背景熒光較弱,對鏡下觀察影響較小。5.磁免疫微流控芯片模擬臨床肺炎鏈球菌檢測,靈敏度達94%,特異度達100%。結(jié)論:1.本研究設(shè)計制作的磁免疫微流控芯片,已解決微流控芯片制作工藝繁雜等問題;選用商品化磁珠,不用化學修飾;無柵欄式結(jié)構(gòu),用外部磁場固定磁珠;制作芯片的過程節(jié)省時間和節(jié)約成本。2.以免疫磁珠為固定相,結(jié)合抗原抗體反應(yīng),增大反應(yīng)比表面積,提高抗原抗體反應(yīng)結(jié)合效率,提高芯片捕獲率和分析速度,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。3.以磁免疫微流控芯片捕獲肺炎鏈球菌,和其他捕獲方法比較,此法具有捕獲率較高、操作間簡單和耗時少等優(yōu)點,對臨床早期檢測有一定幫助。4.成功設(shè)計制作磁免疫微流控芯片,相比臨床實驗室檢測,細菌鑒定無需專業(yè)人員處理樣本、接種培養(yǎng)和生化鑒定。能早期檢測病原菌,指導臨床用藥,利于細菌性腦膜炎早期診治。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5;R515.2
【圖文】：

芯片三層結(jié)構(gòu)設(shè)計圖

b圖 2.2 磁免疫微流控芯片的 CAD 設(shè)計圖a 檢測芯片的設(shè)計圖，b 磁場固定芯片的設(shè)計圖疫微流控芯片的制作方法磁免疫微流控芯片采用模塑制作，主要步驟如圖 2.3 所示。

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本文編號：2721600