【摘要】：研究目的:為滿(mǎn)足臨床快速診斷病原菌的需求,解決微流控芯片制作工藝繁雜等問(wèn)題,本研究采用微細(xì)加工技術(shù),以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsioxane,PDMS)制作蓋片,以玻璃制作基片,構(gòu)建一種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、制作方便、用于病原菌快速檢測(cè)和有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的磁免疫微流控芯片。應(yīng)用于細(xì)菌性腦膜炎病原菌早期鑒別,提升我國(guó)地區(qū)不同規(guī)模醫(yī)院、衛(wèi)生所和疾控中心的檢測(cè)能力。研究方法1.設(shè)計(jì)制作磁免疫微流控芯片和建立芯片檢測(cè)系統(tǒng):本研究采用計(jì)算機(jī)軟件(AutoCAD 2008 Simplified Chinese)設(shè)計(jì)磁免疫微流控芯片CAD圖形,以光刻機(jī)、勻膠機(jī)、PDMS混合儀和等離子清洗機(jī)等儀器制作芯片,以聚二甲基硅氧烷和玻片為主要材料構(gòu)建3層結(jié)構(gòu)微流控芯片。制備的磁免疫微流控芯片與注射器、進(jìn)樣管和出樣管連接,結(jié)合微量注射泵、熒光倒置顯微鏡和高速攝像熒光CCD等儀器,建立磁免疫微流控芯片捕獲檢測(cè)系統(tǒng)。2.修飾免疫磁珠和優(yōu)化捕獲檢測(cè)條件:磁免疫微流控芯片以免疫磁珠為固定相,在芯片外批量修飾磁珠,以外部磁場(chǎng)固定磁珠位置,結(jié)合生物素-親和素放大作用和抗原抗體特異性反應(yīng)等特點(diǎn),選擇最優(yōu)進(jìn)樣速度、檢測(cè)時(shí)間和熒光染料等實(shí)驗(yàn)參數(shù),以最佳檢測(cè)條件鑒定病原菌。3.磁免疫微流控芯片檢測(cè)肺炎鏈球菌:以磁免疫微流控芯片為檢測(cè)平臺(tái),以最佳檢測(cè)條件進(jìn)樣捕獲,以免疫熒光技術(shù)為檢測(cè)方法,驗(yàn)證芯片可用性、捕獲率、特異性、靈敏度和可重復(fù)性等參數(shù),并模擬檢測(cè)臨床標(biāo)本中肺炎鏈球菌。研究結(jié)果1.以PDMS和玻片成功構(gòu)建3層結(jié)構(gòu)磁免疫微流控芯片,包括檢測(cè)芯片層、玻片層和磁場(chǎng)固定芯片層。上層檢測(cè)芯片包括進(jìn)樣口、進(jìn)樣通道、檢測(cè)室、出樣通道和出樣口;中層玻片為封接基片,和上層PDMS蓋片等離子清洗后不可逆封接;下層磁場(chǎng)固定芯片填充磁鐵,磁鐵位置對(duì)應(yīng)檢測(cè)芯片捕獲室,磁場(chǎng)固定芯片和玻璃基片可逆封接,方便磁場(chǎng)重復(fù)使用。2.設(shè)置注射泵進(jìn)樣速度1μL/min、5μL/min、10μL/min和15μL/min,分別注入相同濃度肺炎鏈球菌菌懸液,收集出樣口廢液,計(jì)算芯片捕獲率都高于95%。3.分別檢測(cè)濃度1.5×10~1 CFU/mL~1.5×10~5 CFU/mL的大腸埃希菌ATCC25922,計(jì)算芯片捕獲率都為0。4.同濃度菌懸液用不同工作濃度的AO染色液和碧云天公司配制的Hoechst33342染色液避光染色1h后分別注入磁免疫微流控芯片,在倒置熒光顯微鏡下觀察,用高速攝像CCD拍攝。結(jié)果顯示AO染色液背景熒光較深,影響鏡下觀察檢測(cè);Hoechst 33342染色液背景熒光較弱,對(duì)鏡下觀察影響較小。5.磁免疫微流控芯片模擬臨床肺炎鏈球菌檢測(cè),靈敏度達(dá)94%,特異度達(dá)100%。結(jié)論:1.本研究設(shè)計(jì)制作的磁免疫微流控芯片,已解決微流控芯片制作工藝繁雜等問(wèn)題;選用商品化磁珠,不用化學(xué)修飾;無(wú)柵欄式結(jié)構(gòu),用外部磁場(chǎng)固定磁珠;制作芯片的過(guò)程節(jié)省時(shí)間和節(jié)約成本。2.以免疫磁珠為固定相,結(jié)合抗原抗體反應(yīng),增大反應(yīng)比表面積,提高抗原抗體反應(yīng)結(jié)合效率,提高芯片捕獲率和分析速度,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。3.以磁免疫微流控芯片捕獲肺炎鏈球菌,和其他捕獲方法比較,此法具有捕獲率較高、操作間簡(jiǎn)單和耗時(shí)少等優(yōu)點(diǎn),對(duì)臨床早期檢測(cè)有一定幫助。4.成功設(shè)計(jì)制作磁免疫微流控芯片,相比臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),細(xì)菌鑒定無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員處理樣本、接種培養(yǎng)和生化鑒定。能早期檢測(cè)病原菌,指導(dǎo)臨床用藥,利于細(xì)菌性腦膜炎早期診治。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R446.5;R515.2
【圖文】：

芯片三層結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)圖

b圖 2.2 磁免疫微流控芯片的 CAD 設(shè)計(jì)圖a 檢測(cè)芯片的設(shè)計(jì)圖，b 磁場(chǎng)固定芯片的設(shè)計(jì)圖疫微流控芯片的制作方法磁免疫微流控芯片采用模塑制作，主要步驟如圖 2.3 所示。

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本文編號(hào)：2721600