【摘要】：目的:在全球范圍內(nèi),呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是一種引起嬰幼兒下呼吸道感染常見的病毒病原體,給社會(huì)造成了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Aided Amplification,RAA)是具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的等溫核酸快速檢測技術(shù)。RAA擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測可分為熒光法和側(cè)流層析試紙條法(Lateral Flow Dipstick,LFD)。本研究旨在建立兩種方法實(shí)現(xiàn)呼吸道合胞病毒的快速檢測,一種為含有內(nèi)參的雙重實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(IC-rtRAA),另一種是將RAA技術(shù)與LFD相結(jié)合的LFD-rtRAA技術(shù)。評(píng)價(jià)該兩種檢測方法的靈敏度和特異性,并分別應(yīng)用于臨床標(biāo)本的檢測,進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測效能的評(píng)價(jià)。方法:本研究從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)中下載RSV病毒的全基因序列,并利用Vector NTI軟件進(jìn)行序列比對(duì),找出其保守區(qū)(靶基因區(qū))。1.IC-rtRAA檢測方法:根據(jù)RAA引物探針設(shè)計(jì)原則,并針對(duì)比對(duì)出的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針數(shù)條,隨后篩選出最優(yōu)的引物探針組合。在本實(shí)驗(yàn)中,首先建立了單重實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(Singleplex-rtRAA),隨后在此基礎(chǔ)上加入內(nèi)參,建立了含有內(nèi)參的雙重實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(IC-rtRAA)。2.LFD-rtRAA檢測方法:根據(jù)RAA-LFD引物探針的設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)了適用于LFD-rtRAA法的引物探針,并進(jìn)行相應(yīng)的修飾,建立了LFD-rtRAA檢測方法。用含有靶基因的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)此兩種方法進(jìn)行靈敏度的評(píng)價(jià);用其他常見呼吸道病毒進(jìn)行特異性的評(píng)價(jià);分別利用已建立好的IC-rtRAA檢測方法和LFD-rtRAA檢測方法與文獻(xiàn)報(bào)道的RT-qPCR方法同時(shí)檢測278份臨床標(biāo)本,計(jì)算Kappa值,進(jìn)行檢測結(jié)果一致性比較,評(píng)估該兩種方法的臨床檢測效能。結(jié)果:1.IC-rtRAA法的分析靈敏度為5.0拷貝/反應(yīng),未與其他常見呼吸道病毒發(fā)生交叉反應(yīng),特異性良好。采用該方法檢測278例臨床標(biāo)本,結(jié)果與RSV RT-qPCR分析結(jié)果完全一致。2.LFD-rtRAA法可檢測到的最低RSV質(zhì)粒濃度為10拷貝/反應(yīng),未與其他常見呼吸道病毒發(fā)生交叉反應(yīng),特異性良好。采用該方法檢測278例臨床標(biāo)本,結(jié)果與IC-rtRAA法和RSV RT-qPCR分析結(jié)果完全一致。結(jié)論:本研究建立的兩種RAA檢測方法在快速檢測RSV方面具有很大的應(yīng)用潛力,簡便快速且具有較高的靈敏度和特異性,為呼吸道合胞病毒的檢測提供了新工具。IC-rtRAA檢測方法中內(nèi)參的引入,保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,有利于其在臨床上的應(yīng)用,且內(nèi)參設(shè)計(jì)中所采取的策略對(duì)基于RAA的檢測技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用具有一定的參考價(jià)值。LFD-rtRAA檢測方法更適用于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)或現(xiàn)場快速檢測。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R511;R440
【圖文】：

LFD-rtRAA法nfo探針和擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)示意圖

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2721207