【摘要】：隨著社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,人們對生存環(huán)境和人體健康日益關(guān)注。即時檢測(point-of-care testing,POCT)作為一種低成本、高效準(zhǔn)確以及便攜性強(qiáng)的分析設(shè)備,在醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測以及食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域得到了廣泛的重視。自從微流控芯片被發(fā)現(xiàn),它一直是人們最歡迎的POCT平臺。微流控芯片是微型全分析系統(tǒng)中的重要技術(shù),被稱為“建立在芯片上的實(shí)驗(yàn)室”。它具有獨(dú)立的分析系統(tǒng)可以在微型設(shè)備上的微型范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)操作。其中,紙基微流控芯片(microfluidic paper-based analytical devices,μPAD)是微流控芯片中的最新發(fā)展領(lǐng)域。它以親水性濾紙為基底,利用光刻、石蠟打印以及噴墨打印等技術(shù)制作而成,還可以結(jié)合比色、電化學(xué)、熒光以及化學(xué)發(fā)光等檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)多種分析物的同時檢測。天然酶是化學(xué)反應(yīng)中的生物催化劑,具有高催化效率,高選擇性和底物特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。然而,大部分天然酶在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等條件下穩(wěn)定性差,酶分子結(jié)構(gòu)容易降解,導(dǎo)致失活。酶固定化已被證明是一種在惡劣條件下能保持酶的催化活性和增強(qiáng)酶穩(wěn)定性的有效方法。Zare課題組首次報(bào)道了以Cu3(PO4)2·3H2O為無機(jī)組分,牛血清白蛋白(BSA)為有機(jī)組分,在室溫下通過一步共沉淀法合成了BSA-Cu3(PO4)2雜化納米花。與傳統(tǒng)兩步酶固定化方法相比,這種自組裝法將固定化載體的合成與酶的固定化簡化成一步,實(shí)現(xiàn)了各種酶的納米級固定化。該方法制備的固定化酶具備納米材料的納米級結(jié)構(gòu)以及高比表面積,有利于在催化反應(yīng)中酶和底物的接觸、減少傳質(zhì)限制,保持了酶的催化活性以及提高了穩(wěn)定性和耐久性。自組裝法還可以實(shí)現(xiàn)雙酶同時固定,固定的多種天然酶之間具有良好的生物相容,是一種良好的納米生物催化劑可用于開發(fā)高效準(zhǔn)確、快速簡便的納米生物催化系統(tǒng)應(yīng)用于POCT。本課題我們構(gòu)建了一個基于μPAD結(jié)合酶-無機(jī)雜化納米花的納米生物催化系統(tǒng),應(yīng)用于全血中多生物標(biāo)志物的分析。本課題第一章介紹了酶固定化的物理吸附法、共價結(jié)合法以及自組裝法。并詳細(xì)介紹了酶-無機(jī)雜化納米花的合成方法、優(yōu)勢、種類、形成機(jī)理和應(yīng)用。接著,介紹了μPAD的優(yōu)點(diǎn)、制作方法、檢測技術(shù)以及應(yīng)用。最后,扼要論述了本論文的研究意義和研究內(nèi)容。本課題第二章報(bào)道了利用葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過氧化物酶(HRP)為有機(jī)組分,Cu3(PO4)2·3H2O為無機(jī)組分,在室溫下通過共沉淀法制備具有高催化活性、高選擇性、較好單分散性的GOxHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花。并利用掃描電子顯微鏡(SEM)、X射線粉末衍射(XRD)、能譜分析(EDX)對GOxHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花的形貌、組成、結(jié)構(gòu)以及對形成過程進(jìn)行了探討。接著,設(shè)計(jì)了一個基于μPAD結(jié)合GOxHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花的納米生物催化系統(tǒng)運(yùn)用于對全血中葡萄糖的定量分析。在最佳條件下,我們設(shè)計(jì)的生物傳感器對葡萄糖的檢測下限達(dá)到了25μmol·L-1,耗時短,靈敏性高。由于上述(第二章)紙基納米生物催化系統(tǒng)只實(shí)現(xiàn)了對單一物質(zhì)進(jìn)行分析,在實(shí)際生活中無法廣泛推廣。特別是在一些發(fā)展中國家和一些資源貧乏、醫(yī)療設(shè)備缺失的地區(qū),他們更需要多元化POCT分析設(shè)備。而μPAD易于折疊形成分枝或設(shè)計(jì)多通路微通道,十分有利于開發(fā)多元化的POCT分析設(shè)備。在第三章我們開發(fā)了一個基于μPAD結(jié)合雙酶-無機(jī)雜化納米花的多元化POCT分析裝置。該分析裝置利用比色法檢測技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)同時靈敏檢測全血中的葡萄糖和尿酸的濃度。在這里,我們首次合成了以尿酸酶(UAO)和HRP為有機(jī)成分,Cu3(PO4)2·3H2O為無機(jī)成分的UAOHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花。并對它的形貌、組成、合成時間、性能以及形成機(jī)理進(jìn)行了探討。接著,在最佳合成條件下,我們提前制備好GOxHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花、UAOHRP-Cu3(PO4)2雜化納米花懸浮液,避光放置在4℃?zhèn)溆谩２⒗煤啽愕氖灤蛴C(jī)將設(shè)計(jì)好的μPAD圖案打印在濾紙上,熱處理使固體石蠟完全熔化滲透進(jìn)濾紙中形成疏水屏障,從而得到具有親疏水通道的μPAD。接著,將提前制備好的雜化納米花和各自的顯色指示劑混合在一起,分別滴加到對應(yīng)的檢測區(qū)域,干燥后備用。最后,在中心區(qū)滴加一定量的全血溶液,樣品通過毛細(xì)管作用自發(fā)地從中心區(qū)分布到檢測區(qū)域發(fā)生顯色反應(yīng)。反應(yīng)10分鐘后,利用相機(jī)記錄顏色信號變化。將圖片轉(zhuǎn)換成灰度值,利用圖片處理軟件image J分析顏色強(qiáng)度和梯度,將顏色信號數(shù)字化。從而實(shí)現(xiàn)全血樣品中葡萄糖和尿酸的同時快速和定量分析。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：O643.36;R446.1
【圖文】：

碩士學(xué)位論文酶相比，它表現(xiàn)出增強(qiáng)的酶活性和穩(wěn)定性。Zare 等人通過自組裝法將固定化載體的合成與酶的固定化簡化成一步，從而實(shí)現(xiàn)了各種酶的納米級固定化。該方法固定化酶具有納米材料的納米級結(jié)構(gòu)以及高比表面積，有利于在酶催化反應(yīng)中減少酶和和底物的傳質(zhì)限制，保持了酶的催化活性以及增強(qiáng)了酶的穩(wěn)定性，是一種不同于傳統(tǒng)的“納米酶”的納米生物催化劑。1.2 酶-無機(jī)雜化納米花如圖 1.1 所示，Zare 課題組[11]利用 α-乳清蛋白酶、漆酶、碳酸酐酶、脂肪酶等幾種酶為蛋白質(zhì)組分，Cu3(PO4)2·3H2O、為無機(jī)組分，通過自組裝的方法合成了幾種酶-無機(jī)雜化納米花。研究表明，與游離酶和傳統(tǒng)固定化酶相比較，酶-無機(jī)雜化納米花不僅保持了酶的催化活性還提高了耐久性和穩(wěn)定性。他們利用漆酶-無機(jī)

圖 1.4 （A）不活躍的 α-淀粉酶中的變構(gòu)位點(diǎn)與 Ca2+結(jié)合生成具有活性 α-淀粉酶；（B，Cα-淀粉酶固定在較薄或較厚的 CaHPO4納米晶體中，隨 CaHPO4納米晶體厚度的增加，嵌入淀粉酶分子與暴露分子的比例增加Wang 等人[32]也提出了一種利用 Ca2+的雜化納米花，這種制備方法不同以往共沉淀法，但形成機(jī)理相似。首先利用殼聚糖（CS）與三聚磷酸酯(TPP)離子鍵法制得 CS-TPP 凝膠復(fù)合物。接著 Ca2+與 TPP 形成 Ca2P2O7晶體，最后與 CS-T凝膠復(fù)合物反應(yīng)得到雜化納米花（如圖 1.5）。已制備好的雜化納米花由 23.0 %

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李向堂;張禮春;趙書林;;基于微流控芯片電泳化學(xué)發(fā)光檢測人單個紅細(xì)胞中血紅蛋白的含量[J];分析測試學(xué)報(bào);2015年03期

2 嚴(yán)春芳;余思揚(yáng);蔣艷;何巧紅;陳恒武;;基于等離子體技術(shù)制作微流控紙芯片及其在血糖檢測中的應(yīng)用研究[J];化學(xué)學(xué)報(bào);2014年10期

3 張慧妍;張珍;吉邢虎;何治柯;;紙基微孔陣列芯片比色法檢測乳酸脫氫酶[J];分析化學(xué);2014年09期

4 王韌;王婷;張蕾蕾;;微流控芯片即時檢驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2013年13期

本文編號：2720008