【摘要】：研究背景:慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)是引起異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者無(wú)復(fù)發(fā)死亡最常見(jiàn)并發(fā)癥,可累及全身各個(gè)組織和器官,并且嚴(yán)重影響allo-HSCT長(zhǎng)期存活患者的生存質(zhì)量和重返社會(huì)的能力[1,33]。約30%-70%的allo-HSCT患者會(huì)發(fā)生cGVHD[2,15]。目前,由于cGVHD的免疫細(xì)胞和分子機(jī)制尚不明確,因此對(duì)cGVHD的有效預(yù)防與治療進(jìn)展緩慢。既往,對(duì)于參與cGVHD病理過(guò)程的免疫細(xì)胞的研究一般采用流式細(xì)胞技術(shù)。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀,是基于熒光發(fā)射的檢測(cè)系統(tǒng),不同的熒光基團(tuán)發(fā)射光譜存在重疊現(xiàn)象,因此,目前可同時(shí)檢測(cè)的熒光信號(hào)標(biāo)記一般少于15個(gè),同時(shí)信號(hào)標(biāo)記之間容易互相干擾,這在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。目前新興的質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)(cytometry by time-of-flight,CyTOF)),以在細(xì)胞中含量極低的鑭系金屬代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光蛋白來(lái)標(biāo)記抗體,由于無(wú)需校正光譜的重疊干擾,可以同時(shí)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞的最多100個(gè)標(biāo)記,因此成為研究復(fù)雜免疫系統(tǒng)的有效手段。通過(guò)質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù),我們能夠從廣度、深度研究參與cGVHD病理生理過(guò)程的免疫細(xì)胞亞群及其相應(yīng)特征,為進(jìn)一步揭示慢性移植物抗宿主病的發(fā)病機(jī)制提供新思路。目的:本研究為明確cGVHD患者的免疫細(xì)胞圖譜,通過(guò)質(zhì)譜流式技術(shù)深入分析免疫細(xì)胞亞群失衡在慢性移植物抗宿主病發(fā)生發(fā)展中的作用,從而進(jìn)一步探索靶向特定免疫機(jī)制的慢性移植物抗宿主病治療新策略。方法:(1)確定單細(xì)胞質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)所需的42種免疫標(biāo)記,初步構(gòu)建上機(jī)方案,前期采集檢測(cè)樣本,單細(xì)胞質(zhì)譜流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,檢測(cè)抗體質(zhì)量,質(zhì)檢通過(guò)后正式構(gòu)建慢性移植物抗宿主病CyTOF檢測(cè)人體免疫試劑盒(包含42種CyTOF抗體,包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、DC細(xì)胞、漿細(xì)胞和粒細(xì)胞、髓系細(xì)胞等細(xì)胞亞群標(biāo)記);(2)接受allo-HSCT患者按照NIH診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)分為無(wú)cGVHD患者組、中度cGVHD患者組、重度cGVHD患者組,同時(shí)按照病人cGVHD累及器官分為以皮膚cGVHD癥狀為主患者組和以肺部cGVHD癥狀為主患者組;(3)臨床上收集異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者外周血標(biāo)本31例,記錄詳細(xì)病程信息,同時(shí)收集健康捐獻(xiàn)者外周血標(biāo)本5例,所有參與研究者均需排除感染情況和自身免疫性疾病,空腹抽取靜脈血10ml,EDTA抗凝,24小時(shí)內(nèi)密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,每個(gè)待檢測(cè)樣本選取3×106個(gè)外周血單個(gè)核細(xì)胞染色質(zhì)譜流式上機(jī)檢測(cè),剩余細(xì)胞-80攝氏度冰箱冷凍24小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮中保存;(4)上機(jī)檢測(cè)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。生物信息學(xué)方法:(1)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理及質(zhì)量控制:對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理,并去除批次等噪音影響,得到單個(gè)、活的、免疫細(xì)胞的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步分析;(2)聚類(lèi)分析:選擇上機(jī)方案中指定的信號(hào)標(biāo)記,采用xshift聚類(lèi)算法進(jìn)行分析;當(dāng)單個(gè)文件細(xì)胞數(shù)量過(guò)大時(shí),對(duì)數(shù)據(jù)采用隨機(jī)降采樣的方法以減少細(xì)胞數(shù)并同時(shí)不加入人為操作偏差。通過(guò)高性能的聚類(lèi)算法獲得對(duì)樣本的免疫細(xì)胞亞群的分類(lèi)(cluster);(3)聚類(lèi)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及可視化展示:采用基于t分布隨機(jī)領(lǐng)域嵌入(t-distributed stochastic neighbor embedding,t-SNE)的降維可視化方法對(duì)所獲得的聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行可視化,并獲得可視化隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)嵌入(visual stochastic network embedding,viSNE)、熱圖(heatmap)等可視化展示;同時(shí),對(duì)各樣本中每個(gè)亞群的百分比(Frequency)進(jìn)行差異性分析,根據(jù)病人臨床信息,對(duì)樣本進(jìn)行分組,采用雙邊t檢驗(yàn)的方法確認(rèn)不同組別之差異性表達(dá)的特征免疫亞群。結(jié)果:(1)自2017年11月-2018年12月共收集31例異基因造血干細(xì)胞移植后患者外周血樣,其中12例患者未發(fā)生cGVHD,7例患者發(fā)生中度cGVHD,12例患者發(fā)生重度cGVHD。在19例發(fā)生中度-重度cGVHD患者中,10例患者以皮膚cGVHD癥狀為主要臨床表現(xiàn),6例患者主要表現(xiàn)為肺部cGVHD癥狀,3例患者同時(shí)出現(xiàn)皮膚與肺部cGVHD癥狀;(2)通過(guò)質(zhì)譜流式檢測(cè)各分組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞亞群組成和免疫表型,我們發(fā)現(xiàn),中-重度cGVHD患者組與無(wú)cGVHD患者組相比,具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜;(3)以肺部癥狀為主cGVHD患者組與無(wú)cGVHD患者組相比,具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜;(4)以皮膚癥狀為主cGVHD患者組與無(wú)cGVHD患者組相比,具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜;(5)中度cGVHD患者的外周血中骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞的比例高于無(wú)cGVHD患者組,重度cGVHD患者的外周血中單核吞噬細(xì)胞的比例高于無(wú)cGVHD患者組;(6)以肺部癥狀為主cGVHD患者的外周血中兩群特異的T細(xì)胞亞群(C5,C21)的比例高于無(wú)cGVHD患者組和以皮膚癥狀為主cGVHD患者組;(7)小鼠異基因骨髓移植模型構(gòu)建后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)移植嵌合度,得到H2-Kb陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比超過(guò)90%,檢測(cè)結(jié)果為完全嵌合,小鼠異基因骨髓移植模型建立成功;(8)小鼠cGVHD模型流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)cGVHD嚴(yán)重程度與外周血CD11b+髓系細(xì)胞群的比例成正相關(guān)關(guān)系。結(jié)論:(1)骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞與單核吞噬細(xì)胞可能與cGVHD的病理機(jī)制有關(guān);(2)兩群T細(xì)胞亞群可能參與肺部cGVHD的病理過(guò)程;(3)小鼠cGVHD模型證實(shí)CD11b+髓系細(xì)胞群可能與cGVHD的病理機(jī)制有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R457.7
【圖文】：

ｃＧＶＨＤ患者組相比具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜逡逑通過(guò)ＣｙＴＯＦ檢測(cè)發(fā)現(xiàn)６例以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者與１２例無(wú)ｃＧＶＨＤ逡逑患者相比，外周血單個(gè)核細(xì)胞具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜（圖２）。逡逑ＡＢＣ逡逑圖２，無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組與以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ對(duì)比。圖Ａ為逡逑無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｂ為以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析逡逑后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｃ為無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組與以肺部癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ逡逑對(duì)比圖�？赏ㄟ^(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)部分差異細(xì)胞亞群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２

逡逑ｃＧＶＨＤ患者相比，外周血單個(gè)核細(xì)胞具有不同的細(xì)胞亞群分布圖譜（圖３）。逡逑ＡＢＣ逡逑圖３，無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組與以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ對(duì)比。圖Ａ為逡逑無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｂ為以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析逡逑后ｖｉＳＮＥ圖，圖Ｃ為無(wú)ｃＧＶＨＤ患者組與以皮膚癥狀為主ｃＧＶＨＤ患者組聚類(lèi)分析后ｖｉＳＮＥ逡逑對(duì)比圖�？赏ㄟ^(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)部分差異細(xì)胞亞群。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ３

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