【摘要】：真菌是自然界常見且種類繁多的異養(yǎng)型真核生物,其中與對人類健康產(chǎn)生影響的約300多種,造成感染的類型主要分為淺表感染(例如真菌性皮膚病)和深部感染(或稱侵襲性真菌感染)。全世界范圍內(nèi)約有17億人受到淺表真菌感染的影響,但其不構(gòu)成生命威脅。侵襲性真菌感染與之相反死亡率極高,以侵襲性曲霉病為例,部分患者人群中診斷和治療的延誤會導致死亡率接近100%。每年因侵襲性真菌感染導致死亡的患者人數(shù)高達到150萬人,免疫抑制人群增加(例如HIV、血液病、器官移植患者等)和侵入性醫(yī)療干預是導致侵襲性真菌感染呈上升趨勢的主要原因。肺是最常見的深部真菌感染受累器官,因此對呼吸道常見致病真菌進行快速早期檢測具有很高的臨床應用價值。念珠菌和曲霉是呼吸道中最常見的條件致病真菌,本研究中以痰液樣本為檢材,首次建立了基于微液滴數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)的呼吸道中多靶標真菌(念珠菌、曲霉)檢測方法,初步對該方法在肺曲霉病診斷的臨床應用情況進行了研究。研究結(jié)果表明,該方法的靈敏高、特異性好、臨床適用性強,是一種有前景的臨床常見呼吸道真菌快速精準檢測方法。目前用于肺部真菌感染檢測的新型方法主要有G試驗、GM試驗、質(zhì)譜、測序、PCR等,對應樣本來源主要有靜脈血、肺泡灌洗液、支氣管刷片和肺組織樣本,此類樣本的獲取需侵入性操作對患者具有創(chuàng)傷性。痰液是無需侵入性操作即可獲取的非無菌臨床樣本,目前對痰液樣本進行真菌感染檢測的報道較少,主要原因是其成分的復雜性。本研究中基于痰液樣本和ddPCR技術(shù)建立了對8種呼吸道常見真菌(白色念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉和土曲霉)的檢測方法并進行了驗證。實驗結(jié)果表明該方法的分析靈敏度高,所有真菌靶標在2-2×104拷貝的檢測范圍內(nèi)的線性好,R2均大于0.99,引物探針特異性強,與其他細菌、真菌或人細胞株無交叉反應,對臨床曲霉或念珠菌分離株檢出率為100%。該方法對僅含5個曲霉(煙曲霉和黃曲霉)孢子的模擬痰液樣本可進行有效檢出,進一步對已知培養(yǎng)結(jié)果的29例痰液樣本進行檢測,結(jié)果顯示一致性為96.5%,其中1例絲狀真菌陰性培養(yǎng)樣本中有煙曲霉檢出,7例陽性培養(yǎng)結(jié)果樣本中檢出真菌混合陽性結(jié)果。最終通過二代測序方法對ddPCR檢測結(jié)果進行驗證,二代測序結(jié)果證明了 ddPCR檢測結(jié)果的精準可靠。隨后ddPCR真菌檢測方法被首次應用于肺曲霉病的診斷。肺曲霉病是由曲霉感染引起的嚴重疾病,已有研究表明曲霉在樣本中的載量與感染狀態(tài)相關(guān)聯(lián),目前曲霉載量尚無定量標準且報道較少。ddPCR方法具有絕對定量和對復雜樣本分析的優(yōu)勢,可對痰液樣本中曲霉載量進行準確定量,.研究中選取了可涵蓋臨床90%以上曲霉的4種曲霉靶標(煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉)進行檢測。首先對收集的18位肺曲霉病患者和99位非肺曲霉病患者進行了臨床特征和風險因素分析,分析結(jié)果表明肺結(jié)核、支氣管擴張和長期使用激素或免疫抑制劑是肺曲霉病的主要風險因素。160例臨床樣本的ddPCR檢測結(jié)果顯示,肺曲霉病組患者的曲霉檢出率為84.2%,非肺曲霉病組患者的曲霉檢出率為8.2%,肺曲霉病組檢出菌株以煙曲霉為主。隨后肺曲霉病組患者進一步分為包含或不包含變應性支氣管肺曲霉菌病(allergic bronchopulmonary aspergillosis,ABPA)組進行受試者工作特征曲線(Receiver Operating Characteristic curve,ROC)分析,結(jié)果顯示前者在檢測閾值為20.2拷貝時的靈敏度和特異性可達81.6%和95.1%,后者在檢測閾值為39.9拷貝時的靈敏度可達94.7%和99.2,兩者的曲線下面積(Area Under Curve,AUC)值均大于0.9,表明該方法對肺曲霉病的診斷價值高。最后,4位肺曲霉病患者在不同時間點采集的共計17份痰液樣本檢測結(jié)果被用于肺曲霉病的病情監(jiān)測分析,結(jié)果表明ddPCR的檢測結(jié)果變化和患者病情的進展或改善的趨勢一致。本研究以痰液作為檢測樣本,以ddPCR技術(shù)為檢測平臺,建立了一種無創(chuàng)、精確、快速、可靠的呼吸道中真菌檢測方法。該方法可對呼吸道中痕量常見真菌進行準確鑒定,對復合感染樣本中的每種真菌靶標亦可有效檢出,靈敏度高,特異性好,檢出率高�；赿dPCR技術(shù)絕對定量特性,該檢測方法可為樣本中真菌準確載量的確定提供一種有效工具,研究結(jié)果表明本方法可被用于肺曲霉病的診斷,將來有望為肺曲霉病患者的病情監(jiān)測提供一種有效的解決方案。
【圖文】：

邐１３得到的溶液重新上柱，１４０００ｒｐｍ離心２ｍｉｎ。即得到痰液樣。逡逑孢子獲取和計數(shù)逡逑孢子懸液的獲取逡逑孢子被用于本實驗中模擬樣本的制備，選擇曲霉孢子原因如下：達，在菌絲狀態(tài)下難以對投入基因組數(shù)量進行計數(shù)，二、相比念更高的曲霉細胞壁更加堅固，更適用于檢測核酸提取方法。曲霉京協(xié)和醫(yī)院檢驗科提供，具體菌種為經(jīng)Ｓａｎｇｅｒ測序鑒定后的臨床黃曲霉，依據(jù)醫(yī)院真菌孢子懸液制備流程濾去菌絲后制備了濃度大曲霉與黃曲霉孢子懸液。逡逑孢子的計數(shù)逡逑———－－逡逑

圖１．５靶標內(nèi)同一物種不同分離株的檢測情況Ａ：邋４種曲霉菌對應探針種內(nèi)不同逡逑分離株的液滴檢測情況，自上而下依次是煙曲霉６株、黑曲霉３株、黃曲霉３株、逡逑土?
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R519;R440

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