【摘要】：背景和目的:各種原因(導(dǎo)尿操作、骨盆骨折或感染)引起的尿道狹窄通常需要尿道重建術(shù)來恢復(fù)尿道的連續(xù)性,臨床上常采用自體組織(如頰粘膜或包皮)進(jìn)行尿道重建,但此類自體材料來源有限,因此,通過組織工程來構(gòu)建人工尿道,成為解決尿道重建材料缺乏問題的重要手段。近年來,三維生物打印(3D生物打印)在組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,相比于組織工程生物材料傳統(tǒng)的“細(xì)胞-支架”策略,3D生物打印可在支架塑形的同時將種子細(xì)胞均勻分布在支架內(nèi)部,從而提高構(gòu)建生物材料的效率。但3D生物打印過程中往往種子細(xì)胞活力受損,導(dǎo)致其不能在支架內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞功能。向平滑肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的人脂肪干細(xì)胞(human adipose derived stem cells,hADSCs)是尿道組織工程的重要種子細(xì)胞,傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方式耗時相對較長,難以短時間內(nèi)獲得大量定向分化的人脂肪干細(xì)胞,限制了利用定向分化后的hADSCs來構(gòu)建組織工程化尿道的效率。在本研究中,我們將探索改進(jìn)誘導(dǎo)hADSCs定向分化為平滑肌細(xì)胞的方法,并提升誘導(dǎo)后的hADSCs在3D生物打印組織塊中的細(xì)胞活力。進(jìn)一步我們將利用誘導(dǎo)后的hADSCs與3D生物打印相結(jié)合,以組織工程手段構(gòu)建人工尿道,為今后在動物尿道缺損模型中的尿道重建提供新思路和新手段。材料和方法:在本研究中,我們在添加了人轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor β1,TGF-β1)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中懸滴培養(yǎng)hADSCs,形成微組織球(microtissues,MTs),將誘導(dǎo)后的微組織球與普通貼壁誘導(dǎo)的hADSCs進(jìn)行免疫熒光和免疫蛋白印記檢測平滑肌特異標(biāo)志物表達(dá)量的差異。接下來將誘導(dǎo)后的MTs和hADSCs應(yīng)用于3D生物打印,通過活死細(xì)胞染色及CCK-8檢測兩組細(xì)胞存活及增殖狀況。接下來我們將3D生物打印塊包埋在裸鼠皮下孵育1周,并取出后在其表面種植由人輸尿管組織獲取的尿路上皮細(xì)胞(human urothelial cells,hUCs),構(gòu)建人工尿道,對其進(jìn)行組織學(xué)染色觀察內(nèi)部形態(tài)以及肌纖維和膠原纖維的形成、免疫熒光染色評估新生血管和尿路上皮層的形成、免疫組化染色檢測內(nèi)部細(xì)胞表型。結(jié)果:在誘導(dǎo)3天后,MTs組的平滑肌特異性標(biāo)志物a smooth muscle actin(a-SMA)和Smoothel in的表達(dá)量均顯著高于hADSCs組,半定量分析結(jié)果提示MTs組和hADSCs組 α-SMA 表達(dá)量分別為 0.218±0.077 和 0.082±0.007(P0.001),Smoothelin 表達(dá)量分別為0.319±0.02和0.178±0.06(P0.001)�；钏兰�(xì)胞染色提示在打印后不同的時間節(jié)點,MTs組的存活細(xì)胞數(shù)比hADSCs組更多(平均存活細(xì)胞率為88.16%±3.98%和61.76%±15%,P=0.0396),CCK-8檢測提示MTs組細(xì)胞活力在打印后快速恢復(fù)至較高水平。皮下包埋1周后,HE和masson三色染色提示MTs組在體內(nèi)仍然能夠保持其大體形態(tài),周圍有血管樣結(jié)構(gòu)形成,并且形成了較多的肌纖維和少量的膠原纖維;而hADSCs組則變?yōu)閳A形,周圍缺乏血管樣結(jié)構(gòu)。免疫組化染色提示誘導(dǎo)后MTs在體內(nèi)仍表達(dá)平滑肌特異性標(biāo)志物a-SMA和Smoothel in。免疫熒光染色提示MTs組在體內(nèi)形成了環(huán)狀的新生血管結(jié)構(gòu),且在種植尿路上皮細(xì)胞后,表面形成了連續(xù)的尿路上皮層。結(jié)論:將懸滴誘導(dǎo)培養(yǎng)與3D生物打印結(jié)合,并采用裸鼠皮下包埋孵育并種植尿路上皮細(xì)胞的方法,我們構(gòu)建了組織工程化人工尿道,通過相應(yīng)的實驗觀察了其中的種子細(xì)胞形態(tài),檢測了種子細(xì)胞存活狀況和細(xì)胞表型等指標(biāo),為下一步動物尿道缺損模型重建提供了新思路和新手段。
【圖文】：

-4.100720家系患者純音測聽結(jié)果

圖１－１－８．邋１００７０８１家系先證者純音測聽結(jié)果逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R318.16;R699.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 XIONG WenPing;WANG DaYong;GAO Yuan;GAO Ya;WANG HongYang;GUAN Jing;LAN Lan;YAN JunHao;ZONG Liang;YUAN Yuan;DONG Wei;HUANG SeXin;WU KeLiang;WANG YaoShen;WANG ZhiLi;PENG HongMei;LU YanPing;XIE LinYi;ZHAO Cui;WANG Li;ZHANG QiuJing;GAO Yun;LI Na;YANG Ju;YIN ZiFang;HAN Bing;WANG Wei;CHEN Zi-Jiang;WANG QiuJu;;Reproductive management through integration of PGD and MPS-based noninvasive prenatal screening/diagnosis for a family with GJB2-associated hearing impairment[J];Science China(Life Sciences);2015年09期

2 詹悅;胡鈺娟;黃翔;程華茂;郭長凱;肖紅俊;師洪;孔維佳;;特發(fā)性突聾患者GJB2 235delC突變分析[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2014年09期

，

本文編號：2708973