【摘要】：目的:建立一種可同時(shí)定量檢測(cè)人血清中SAA、CRP含量的熒光免疫層析方法。方法:采用雙抗體夾心原理制備SAA、CRP聯(lián)合檢測(cè)熒光免疫層析試紙條,對(duì)標(biāo)記、包被抗體量進(jìn)行研究后,對(duì)試紙條線性范圍、精密性、交叉反應(yīng)等性能指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果:最終確定SAA、CRP標(biāo)記量均為20μg,包被濃度分別為2 mg/ml、1.5 mg/ml,SAA、CRP線性范圍為0.78～200μg/ml;批內(nèi)精密性與批間精密性均小于15%,平均回收率分別為101.7%和103.5%;且SAA和CRP兩種抗原進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)時(shí)無(wú)交叉反應(yīng),與西門(mén)子BN ProSpec~?特定蛋白分析系統(tǒng)上平行檢測(cè)80份臨床血清其相關(guān)性良好。結(jié)論:初步建立了聯(lián)合定量檢測(cè)SAA、CRP的熒光免疫層析方法,為感染性疾病的早期篩查提供一種新的檢測(cè)手段。
【圖文】：

參照文獻(xiàn)[5,6],采用EDC-NHS兩步法活化熒光微球,取5 μl熒光微球加入500 μl 0.05 mol/L 硼酸緩沖液(pH8.0)漩渦振蕩混勻后,加入50 μl EDC溶液(1 mg/ml)和 50 μl NHS溶液(1 mg/ml) 作為活化劑混勻后,振蕩活化30 min;15 000 r/min離心20 min,棄上清;加入800 μl 0.05 mol/L硼酸緩沖液(pH8.0)復(fù)溶沉淀后,再加入20 μg 抗SAAⅠ抗體,室溫下振蕩偶聯(lián)2 h;15 000 r/min 離心20 min,棄上清;加入1 ml微球保護(hù)液復(fù)溶沉淀后,加入10 μl 1%BSA溶液振蕩封閉1 h,置于4℃保存?zhèn)溆谩晒馕⑶驑?biāo)記抗CRP Ⅰ抗體:加入20 μg 抗CRP Ⅰ抗體,其余步驟同熒光微球標(biāo)記抗SAA Ⅰ抗體。熒光微球標(biāo)記兔IgG多克隆抗體:加入10 μg 兔IgG多克隆抗體,其余步驟同熒光微球標(biāo)記SAA Ⅰ 抗體。將3種免疫微球按照體積比1∶1∶1混勻后,按照5 μl/cm噴涂到微球結(jié)合墊上制備成微球墊,37℃干燥2 h。采用三維平面點(diǎn)膜噴金儀,按1 μl/cm將2 mg/ml 鼠抗兔IgG單克隆抗體、 1.5 mg/ml 抗SAA Ⅱ單克隆包被抗體、1.5 mg/ml 抗 CRPⅡ單克隆包被抗體包被于NC膜上分別作為T(mén)1線、T2和C線,37℃干燥2 h。按試紙條組裝方式,組裝好后用切條機(jī)切成3.9 mm寬的試紙條如圖1,裝于帶有干燥劑的鋁箔袋中密封,置于2～8℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 試紙條的檢測(cè)

隨機(jī)抽取3個(gè)不同批次的 SAA、CRP聯(lián)合檢測(cè)免疫層析試紙條,分別對(duì)濃度為 5、10、50 μg/ml的樣本進(jìn)行精密性檢測(cè)。SAA批內(nèi)精密性依次為9.59%、7.13%、4.49%,批間精密性依次為9.44%、6.92%、5.76%;CRP批內(nèi)精密性依次為9.59%、7.13%、4.49%,批間精密性依次為9.44%、6.92%、5.76%。本方法制備的試紙條其批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于15%,符合精密性要求。圖3 CRP標(biāo)準(zhǔn)曲線

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