【摘要】：背景與目的:海洋性弧菌廣泛分布于內(nèi)灣、沿岸、外洋水域、海洋生物體和沉積物中,能夠感染魚類或哺乳動(dòng)物,并可在人群中引起食物中毒。不少弧菌會(huì)導(dǎo)致人或其他動(dòng)物發(fā)病,以霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌致病力最強(qiáng)。隨著海產(chǎn)品消費(fèi)的不斷增多,因海產(chǎn)品傳播的細(xì)菌性疾病發(fā)生范圍和頻率也逐漸增大。常規(guī)的海洋弧菌檢測(cè)方法即培養(yǎng)法不能滿足快速診斷的需要,且某些海洋性弧菌培養(yǎng)困難,因此建立病原性海洋弧菌的快速檢測(cè)技術(shù),對(duì)病原性海洋性弧菌感染的診斷、治療和維護(hù)公共健康具有重要意義。本研究旨在了解威海地區(qū)食源性疾病中致病菌的分布情況,建立一種可以同時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌及副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,為臨床快速診斷創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌感染提供一種有效手段。方法:收集2017年3月~10月威海市立醫(yī)院食源性疾病就診患者的糞便標(biāo)本357例,采用常規(guī)培養(yǎng)法結(jié)合質(zhì)譜分析對(duì)標(biāo)本中病原菌進(jìn)行鑒定。設(shè)計(jì)針對(duì)創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)細(xì)胞溶解素編碼基因vvh A和副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)膠原蛋白酶編碼基因col的特異性引物,建立單一降落PCR和多重降落PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化,檢測(cè)各種標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株評(píng)價(jià)單一降落和多重降落PCR的特異性和敏感性。應(yīng)用多重降落PCR檢測(cè)103例糞便標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌,并與細(xì)菌培養(yǎng)法結(jié)果進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)多重降落PCR在臨床標(biāo)本檢測(cè)中的可行性。結(jié)果:(1)共檢出致病微生物98株,5種疾控要求監(jiān)測(cè)病原微生物致瀉大腸埃希菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、諾如病毒和志賀氏菌的比率依次為26.53%、21.43%、20.41%、10.20%和7.14%;另外還檢出其它致病性海洋弧菌14株(14.28%),包括創(chuàng)傷弧菌6株(6.12%)、哈氏弧菌3株(3.06%)、溶藻弧菌3株(3.06)和燦爛弧菌2株(2.04%),海洋性弧菌的總檢出比率為35.71%。(2)單一降落PCR只分別對(duì)創(chuàng)傷弧菌或副溶血弧菌檢測(cè)到特異擴(kuò)增條帶,對(duì)其它種類弧菌和非弧菌未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶;對(duì)創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的最低檢測(cè)限分別為104 CFU/ml和103CFU/ml。(3)多重降落PCR可在目標(biāo)測(cè)試菌中同時(shí)檢測(cè)到創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的特異性擴(kuò)增條帶,對(duì)其它種類弧菌和非弧菌未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶;對(duì)創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌的最低檢測(cè)限亦分別為104 CFU/ml和103 CFU/ml。(4)與細(xì)菌培養(yǎng)法比較,多重降落PCR檢測(cè)103份糞便標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌的靈敏度和特異性分別為l00%和97.94%,副溶血性弧菌的靈敏度與特異性分別為100%和95.12%。結(jié)論:(1)威海地區(qū)食源性疾病中海洋性弧菌檢出率高,需要對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)。(2)成功建立快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的多重降落PCR方法,靈敏度高,特異性強(qiáng),可直接用于臨床標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的快速檢測(cè)。
【圖文】：

臨床標(biāo)本中副溶血弧菌的質(zhì)譜分析圖 副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株的質(zhì)譜分析圖臨床標(biāo)本中創(chuàng)傷弧菌的質(zhì)譜分析圖 創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)株的質(zhì)譜分析圖圖1 副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌質(zhì)譜分析圖Figure 1 Mass spectrogram of V. vulnificus and V. parahaemolyticus

結(jié)果2 單一降落 PCR 檢測(cè)結(jié)果2.1 單一降落 PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果創(chuàng)傷弧菌單一降落 PCR，，只在創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株中擴(kuò)增出 740 bp 的目的條帶，其它菌株均未見(jiàn) 740 bp 擴(kuò)增條帶（圖 3）。副溶血弧菌單一降落 PCR，只在副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株中擴(kuò)增出 349 bp 的目的條帶，其它菌株均未見(jiàn)349 bp 擴(kuò)增條帶（圖 4）。兩種單一降落 PCR 中，所有菌株均出現(xiàn) 598 bp 16S rDNA擴(kuò)增條帶。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R155.3;R440

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2705665