【摘要】：研究背景:膿毒癥(Sepsis)是一種臨床上由機(jī)體對(duì)感染的異常反應(yīng)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙,是嚴(yán)重?zé)�、�?chuàng)傷及外科大手術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥。最新數(shù)據(jù)顯示,全球每年超過(guò)1900萬(wàn)人罹患膿毒癥,其中死亡人數(shù)超過(guò)530萬(wàn),是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit,ICU)患者的首位死亡原因。前期我們團(tuán)隊(duì)已完成了關(guān)于中國(guó)膿毒癥流行病學(xué)現(xiàn)狀的前瞻性調(diào)查,結(jié)果顯示我國(guó)重癥膿毒癥的發(fā)病率為8.68%,與歐美國(guó)家相當(dāng),這些重癥患者住院期間死亡率高達(dá)50%。因此,探索膿毒癥的防治對(duì)策具有極其重要的臨床意義。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,病原微生物感染和機(jī)體炎癥反應(yīng)是其病理生理學(xué)基礎(chǔ)。病原微生物感染及機(jī)體持續(xù)的炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致膿毒癥患者組織器官損傷,繼而發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征甚至膿毒性休克、多臟器功能衰竭等,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)病原微生物清除能力下降。如若未能控制病情,過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)消耗大量的細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì),導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制,使得病原微生物大量繁殖,病情惡化甚至死亡。所以,早期控制并且有效清除病原微生物,已成為降低重癥膿毒癥如多臟器功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)等發(fā)生率和提高膿毒癥生存率的關(guān)鍵。病原微生物入侵機(jī)體時(shí),固有免疫系統(tǒng)首先作出快速免疫應(yīng)答反應(yīng)。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,其功能變化在膿毒癥早期免疫治療中受到高度關(guān)注。巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗感染效應(yīng)的方式主要為三步:形成吞噬體攝取病原微生物,吞噬體成熟獲得抗菌能力,分泌細(xì)胞因子招募炎性細(xì)胞至感染部位進(jìn)一步清除病原微生物。ERK信號(hào)通路作為MAPK三個(gè)亞型之一參與其中。S1P 受體(sphingosine 1-phosphate receptors,S1 PRs)是一種 G 蛋白偶聯(lián)受體,廣泛分布于心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞,是目前膿毒癥non-TLRs研究的一個(gè)熱點(diǎn)。S1PRs與磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)結(jié)合,啟動(dòng)細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成和炎癥反應(yīng)。S1PR3是S1PRs家族的一個(gè)重要成員,與三種G蛋白(Gi、Gq、G12/G13)發(fā)生偶聯(lián),激活下游PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路,一方面介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向炎癥病灶募集并釋放炎癥因子,另一方面介導(dǎo)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌。既往研究證實(shí),S1PR3基因敲除組小鼠腹腔感染大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)及盲腸結(jié)扎穿孔(cecum ligation and puncture,CLP)誘導(dǎo)的膿毒癥模型后,生存率較野生組小鼠顯著降低,血液、肺、脾及肝的細(xì)菌負(fù)荷增加,并證實(shí)“S1PR3-G protein-Vps34-NOX2/EEA1信號(hào)通路”參與S1PR3調(diào)控巨噬細(xì)胞吞噬體的功能。既往臨床研究也表明,ICU膿毒癥死亡患者的S1PR3 mRNA表達(dá)水平較膿毒癥存活患者顯著降低,重癥膿毒癥患者血液中S1P(S1PR3受體的配體物質(zhì))的濃度明顯低于其他膿毒癥患者及健康志愿者,體內(nèi)S1P的低水平狀態(tài)與膿毒癥患者病死率相關(guān)。因此我們推測(cè),在膿毒癥早期應(yīng)用特異性激動(dòng)S1PR3的藥物將是膿毒癥治療的新策略。研究目的:既往研究證明,KRX-725是同源于S1PR3胞內(nèi)第二個(gè)環(huán)的含9個(gè)氨基酸序列(1 43M-R-P-Y-D-A-N-K-R151)組成并經(jīng)修飾后的短肽,可特異性激活S1PR3,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)菌清除作用,改善膿毒癥預(yù)后,但其跨膜入胞時(shí)間較長(zhǎng),藥物本身的氨基酸序列的穩(wěn)定性不足。本研究對(duì)KRX-725進(jìn)一步優(yōu)化,合成新一代的S1PR3特異性激動(dòng)劑即RY-15,并研究其促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌的作用及機(jī)制,為臨床轉(zhuǎn)化研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。研究方法:KRX-725是同源于S1PR3胞內(nèi)第二個(gè)環(huán)的含9個(gè)氨基酸序列的短肽,該短肽可以特異性激活S1PR3,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)菌清除作用,改善膿毒癥預(yù)后。在此基礎(chǔ)上,我們對(duì)該肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)一步優(yōu)化,并研究其入胞、清除細(xì)菌能力及對(duì)THP-1細(xì)胞ERK通路的磷酸化水平。研究結(jié)果:1.人工合成S1PR3特異性激動(dòng)劑的分子式GY-5、RY-15。2.激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,RY-15作用THP-1細(xì)胞10min后,開(kāi)始入胞;30min后,入胞效果顯著。3.慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RY-15可以顯著降低細(xì)菌被吞噬后巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的大腸桿菌數(shù)量(p0.05),而GY-5則對(duì)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌作用沒(méi)影響。4.Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,GY-5、RY-15均可以使ERK通路磷酸化,而RY-15對(duì)其活化的作用更顯著。研究結(jié)論:S1PR3特異性激動(dòng)劑RY-15可以進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi),促進(jìn)巨噬細(xì)胞清除細(xì)菌,這一作用可能是通過(guò)ERK通路磷酸化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

抗原分子（ｅａｒｌｙ邋ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋１，，ＥＥＡ１邋）、溶酶體相關(guān)膜蛋白邋１邋（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，邋ＬＡＭＰ１邋），邋從而促進(jìn)吞嗤溶酶體的成熟邋，具備完整的逡逑殺菌功能（具體機(jī)制見(jiàn)圖１．１）邋［１４］。既往臨床研究也表明，ＩＣＵ膿毒癥死亡患者的逡逑Ｓ１ＰＲ３邋ｎｉＲＮＡ表徶水平較膿毒癥存活患者顯著降低，重癥膿毒癥患者血液中Ｓ１Ｐ逡逑（Ｓ１ＰＲ３受體的配體物質(zhì)）的濃度明顯低于其他膿毒癥患者及健康志愿者，體內(nèi)逡逑Ｓ１Ｐ的低水平狀態(tài)與膿毒癥患者病死率相關(guān)１１５］。因此我們推測(cè)，在膿毒癥早期應(yīng)用逡逑特異性激動(dòng)Ｓ１ＰＲ３藥物將是膿毒癥治療的新策略。逡逑Ｓ１ＰＲ３＾＾＾＾－邋0邋0°邋0°邋00邋Ａｃｔｉｖａｔｏｒ邋（ｅ．ｇ．，Ｓ１Ｐ）逡逑（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋）逡逑，＇ｒ＿Ｐ邋廣．．逡逑Ｅａｒｌｙ邐（邋／＇逡逑ｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋＼邐Ｊ邋Ｊ邐Ｉ逡逑ＮＯＸ２邋ｐｔｄ丨ｎｓ（３＞§｜：：邋ＥＥＡ１邐／逡逑＾邐／逡逑Ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邐／逡逑ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邐／逡逑圖１．１邋Ｓ１ＰＲ３介導(dǎo)巨噬細(xì)胞殺菌機(jī)制逡逑（見(jiàn)于本課題組前期研究：Ａｍ邋ＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔ邋Ｃａｒｅ邋Ｍｅｄ，２０１７，１９６（１２）：邋１５５９－１５７０．）逡逑３逡逑

為檢測(cè)Ｓ１ＰＲ３特異性激動(dòng)劑ＲＹ－１５的入胞效果，將帶ＦＩＴＣ熒光染料的ＲＹ－１５與逡逑ＴＨＰ－１細(xì)胞系于３７°Ｃ、５％Ｃ０２培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)５ｍｉｎ、ｌＯｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ后，用逡逑激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，如圖３．１。結(jié)果顯示，ＲＹ－１５作用ＴＨＰ－１細(xì)胞１０邋ｍｉｎ逡逑后，開(kāi)始入胞；３０ｍｉｎ后，入胞效果顯著。逡逑１２逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R459.7

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本文編號(hào)：2703856