【摘要】：研究背景:膿毒癥(Sepsis)是一種臨床上由機體對感染的異常反應而導致的危及生命的器官功能障礙,是嚴重燒、創(chuàng)傷及外科大手術后常見的并發(fā)癥。最新數(shù)據(jù)顯示,全球每年超過1900萬人罹患膿毒癥,其中死亡人數(shù)超過530萬,是重癥監(jiān)護室(intensive care unit,ICU)患者的首位死亡原因。前期我們團隊已完成了關于中國膿毒癥流行病學現(xiàn)狀的前瞻性調(diào)查,結果顯示我國重癥膿毒癥的發(fā)病率為8.68%,與歐美國家相當,這些重癥患者住院期間死亡率高達50%。因此,探索膿毒癥的防治對策具有極其重要的臨床意義。膿毒癥的發(fā)病機制十分復雜,病原微生物感染和機體炎癥反應是其病理生理學基礎。病原微生物感染及機體持續(xù)的炎癥反應可以導致膿毒癥患者組織器官損傷,繼而發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征甚至膿毒性休克、多臟器功能衰竭等,導致機體對病原微生物清除能力下降。如若未能控制病情,過度的炎癥反應會消耗大量的細胞因子及炎癥介質(zhì),導致機體免疫抑制,使得病原微生物大量繁殖,病情惡化甚至死亡。所以,早期控制并且有效清除病原微生物,已成為降低重癥膿毒癥如多臟器功能衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)等發(fā)生率和提高膿毒癥生存率的關鍵。病原微生物入侵機體時,固有免疫系統(tǒng)首先作出快速免疫應答反應。巨噬細胞作為機體固有免疫反應中的關鍵效應細胞,其功能變化在膿毒癥早期免疫治療中受到高度關注。巨噬細胞發(fā)揮抗感染效應的方式主要為三步:形成吞噬體攝取病原微生物,吞噬體成熟獲得抗菌能力,分泌細胞因子招募炎性細胞至感染部位進一步清除病原微生物。ERK信號通路作為MAPK三個亞型之一參與其中。S1P 受體(sphingosine 1-phosphate receptors,S1 PRs)是一種 G 蛋白偶聯(lián)受體,廣泛分布于心肌細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞及巨噬細胞、T細胞等免疫細胞,是目前膿毒癥non-TLRs研究的一個熱點。S1PRs與磷脂分子1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)結合,啟動細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導,調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、血管生成和炎癥反應。S1PR3是S1PRs家族的一個重要成員,與三種G蛋白(Gi、Gq、G12/G13)發(fā)生偶聯(lián),激活下游PI3K/Akt、MAPK等信號通路,一方面介導巨噬細胞向炎癥病灶募集并釋放炎癥因子,另一方面介導巨噬細胞清除細菌。既往研究證實,S1PR3基因敲除組小鼠腹腔感染大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)及盲腸結扎穿孔(cecum ligation and puncture,CLP)誘導的膿毒癥模型后,生存率較野生組小鼠顯著降低,血液、肺、脾及肝的細菌負荷增加,并證實“S1PR3-G protein-Vps34-NOX2/EEA1信號通路”參與S1PR3調(diào)控巨噬細胞吞噬體的功能。既往臨床研究也表明,ICU膿毒癥死亡患者的S1PR3 mRNA表達水平較膿毒癥存活患者顯著降低,重癥膿毒癥患者血液中S1P(S1PR3受體的配體物質(zhì))的濃度明顯低于其他膿毒癥患者及健康志愿者,體內(nèi)S1P的低水平狀態(tài)與膿毒癥患者病死率相關。因此我們推測,在膿毒癥早期應用特異性激動S1PR3的藥物將是膿毒癥治療的新策略。研究目的:既往研究證明,KRX-725是同源于S1PR3胞內(nèi)第二個環(huán)的含9個氨基酸序列(1 43M-R-P-Y-D-A-N-K-R151)組成并經(jīng)修飾后的短肽,可特異性激活S1PR3,增強巨噬細胞細菌清除作用,改善膿毒癥預后,但其跨膜入胞時間較長,藥物本身的氨基酸序列的穩(wěn)定性不足。本研究對KRX-725進一步優(yōu)化,合成新一代的S1PR3特異性激動劑即RY-15,并研究其促進巨噬細胞清除細菌的作用及機制,為臨床轉(zhuǎn)化研究提供實驗室依據(jù)。研究方法:KRX-725是同源于S1PR3胞內(nèi)第二個環(huán)的含9個氨基酸序列的短肽,該短肽可以特異性激活S1PR3,增強巨噬細胞細菌清除作用,改善膿毒癥預后。在此基礎上,我們對該肽的結構進一步優(yōu)化,并研究其入胞、清除細菌能力及對THP-1細胞ERK通路的磷酸化水平。研究結果:1.人工合成S1PR3特異性激動劑的分子式GY-5、RY-15。2.激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,RY-15作用THP-1細胞10min后,開始入胞;30min后,入胞效果顯著。3.慶大霉素保護實驗發(fā)現(xiàn),RY-15可以顯著降低細菌被吞噬后巨噬細胞內(nèi)存活的大腸桿菌數(shù)量(p0.05),而GY-5則對巨噬細胞清除細菌作用沒影響。4.Western Blot實驗結果顯示,GY-5、RY-15均可以使ERK通路磷酸化,而RY-15對其活化的作用更顯著。研究結論:S1PR3特異性激動劑RY-15可以進入到細胞內(nèi),促進巨噬細胞清除細菌,這一作用可能是通過ERK通路磷酸化來實現(xiàn)的。
【圖文】：

抗原分子（ｅａｒｌｙ邋ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋１，，ＥＥＡ１邋）、溶酶體相關膜蛋白邋１邋（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－逡逑ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，邋ＬＡＭＰ１邋），邋從而促進吞嗤溶酶體的成熟邋，具備完整的逡逑殺菌功能（具體機制見圖１．１）邋［１４］。既往臨床研究也表明，ＩＣＵ膿毒癥死亡患者的逡逑Ｓ１ＰＲ３邋ｎｉＲＮＡ表徶水平較膿毒癥存活患者顯著降低，重癥膿毒癥患者血液中Ｓ１Ｐ逡逑（Ｓ１ＰＲ３受體的配體物質(zhì)）的濃度明顯低于其他膿毒癥患者及健康志愿者，體內(nèi)逡逑Ｓ１Ｐ的低水平狀態(tài)與膿毒癥患者病死率相關１１５］。因此我們推測，在膿毒癥早期應用逡逑特異性激動Ｓ１ＰＲ３藥物將是膿毒癥治療的新策略。逡逑Ｓ１ＰＲ３＾＾＾＾－邋0邋0°邋0°邋00邋Ａｃｔｉｖａｔｏｒ邋（ｅ．ｇ．，Ｓ１Ｐ）逡逑（Ｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋）逡逑，＇ｒ＿Ｐ邋廣．．逡逑Ｅａｒｌｙ邐（邋／＇逡逑ｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋＼邐Ｊ邋Ｊ邐Ｉ逡逑ＮＯＸ２邋ｐｔｄ丨ｎｓ（３＞§｜：：邋ＥＥＡ１邐／逡逑＾邐／逡逑Ｏｘｙｇｅｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ａｎｄ邋ｏｘｙｇｅｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邐／逡逑ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邐／逡逑圖１．１邋Ｓ１ＰＲ３介導巨噬細胞殺菌機制逡逑（見于本課題組前期研究：Ａｍ邋ＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔ邋Ｃａｒｅ邋Ｍｅｄ，２０１７，１９６（１２）：邋１５５９－１５７０．）逡逑３逡逑

為檢測Ｓ１ＰＲ３特異性激動劑ＲＹ－１５的入胞效果，將帶ＦＩＴＣ熒光染料的ＲＹ－１５與逡逑ＴＨＰ－１細胞系于３７°Ｃ、５％Ｃ０２培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)５ｍｉｎ、ｌＯｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ后，用逡逑激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，如圖３．１。結果顯示，ＲＹ－１５作用ＴＨＰ－１細胞１０邋ｍｉｎ逡逑后，開始入胞；３０ｍｉｎ后，入胞效果顯著。逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R459.7

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本文編號：2703856