【摘要】：目的:隨著我國航天事業(yè)的不斷發(fā)展以及在太空中探索時間的不斷延長,航天員感染的風險也逐漸升高,空間微生物學的研究越來越受到國家重視。本研究旨在探索模擬空間環(huán)境下低剪切力對肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表達的影響及其可能的機制,為空間和地面感染防控研究的靶標篩選提供新的思路和依據(jù)。方法:本研究中,以肺炎克雷伯氏菌ATCC BAA-1705菌株M1亞群菌株為研究對象,以0 rpm(靜置)、SMG、50 rpm、100 rpm、200 rpm這五種不同且依次增高的剪切力為培養(yǎng)條件,設(shè)計了一系列實驗,包括甘露糖抑制的酵母凝集試驗、透射電鏡觀察、c-di-GMP提取、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR、轉(zhuǎn)錄組測序分析、敲除平臺的建立等。首先,通過甘露糖抑制的酵母凝集和透射電鏡觀察不同剪切力對肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表達的影響,然后利用肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因進行熒光定量PCR和轉(zhuǎn)錄組測序分析,對之前的表型實驗結(jié)果進行驗證,最后通過c-di-GMP表達水平的檢測、c-di-GMP相關(guān)GGDEF基因的轉(zhuǎn)錄組測序分析及熒光定量PCR等試驗對分子機制進行研究。結(jié)果:甘露糖抑制的凝集試驗顯示,低剪切力的SMG、0 rpm、50 rpm三組凝集量多,而高剪切力的100 rpm、200 rpm兩組凝集量相對少,且200 rpm組凝集量最少。凝集效價分析中,取以5為底的對數(shù)后,各組凝集效價的平均值分別為6.67、5.67、5.67、4、2.67,數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA分析具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn),低剪切力SMG、0 rpm、50 rpm條件下培養(yǎng)的肺克,可觀察到的III型菌毛多,而高剪切力100 rpm、200 rpm組少。通過qRT-PCR試驗及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),低剪切力的條件下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛結(jié)構(gòu)基因及相應(yīng)調(diào)控基因表達上調(diào),與之前表型試驗結(jié)果相吻合。第二信使c-di-GMP的檢測結(jié)果中,SMG、50 rpm、200 rpm組c-di-GMP的平均表達水平分別為27.15ng/m L、56.3 ng/m L和84.1 ng/mL。針對17個c-di-GMP表達相關(guān)的GGDEF基因進行轉(zhuǎn)錄組測序分析,并與qRT-PCR試驗結(jié)果相比對,發(fā)現(xiàn)了7個差異表達較顯著的基因(KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和KPHS-47910)。結(jié)論:甘露糖抑制的酵母凝集試驗和透射電鏡觀察兩個表型試驗均顯示,隨著剪切力的增高,III型菌毛的表達降低,這提示低剪切力可能促進肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表達。通過qRT-PCR試驗及轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),低剪切力的條件下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛結(jié)構(gòu)基因及相應(yīng)調(diào)控基因表達上調(diào),進一步驗證了以上發(fā)現(xiàn)。之后,針對c-di-GMP相關(guān)的GGDEF基因的研究顯示,隨著剪切力的降低,KPHS-06770、KPHS-17760、KPHS-29590、KPHS-38170、KPHS-39010、KPHS-39950和KPHS-47910這7個基因表達明顯升高。因此,我們推測,低剪切力促進肺炎克雷伯氏菌III型菌毛表達的分子機制有可能是以上7個基因中的一個或多個基因表達上調(diào),造成局部的c-di-GMP表達水平增高,從而促進肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表達。以上研究提示,在低剪切力的空間環(huán)境下,肺炎克雷伯氏菌III型菌毛的表達增加,可能造成其生物被膜和致病能力改變,從而對航天員的健康構(gòu)成潛在的威脅。
【圖文】：

圖 2.1 肺克 M1 亞群菌株在不同剪切力下的生長狀況Fig 2.1 The growth conditions of the M1 subgroup strains of Klebsiella pneumoniaunder different shearing forces甘露糖抑制的酵母凝集試驗初，本試驗分別以對數(shù)中期和對數(shù)后期的細菌進行甘露糖抑制的酵母凝但是從凝集結(jié)果來看，對數(shù)后期的凝集量更多，更有利于后續(xù)的試驗觀察后進行的試驗均以對數(shù)后期培養(yǎng)的菌為研究對象。試驗中以對數(shù)后期培養(yǎng)的細菌為研究對象，，甘露糖抑制的酵母凝集試驗，低剪切力的 SMG、0 rpm、50 rpm 三組凝集量多，而高剪切力的 100 rpm 兩組凝集量相對少。200 rpm 組的凝集量比 100 rpm 組少，且在五組中少，如圖 2.2 所示。隨后，SMG、0 rpm、50 rpm、100 rpm、200 rpm5 倍梯度稀釋后分別進行凝集試驗，觀察各組凝集情況，以觀察到凝集的

圖 2.2 甘露糖抑制的酵母凝集試驗Fig 2.2 The mannose-suppressed yeast-agglutination tests of the M1 subgroup strainsKlebsiella pneumoniae注：圖中為 SMG、0 rpm、50 rpm、100 rpm、200 rpm 五種不同剪切力條件下肺炎克 III 型菌毛的酵母凝集試驗結(jié)果，圖中以不同剪切力代表各自的組別。）
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R446.5

【參考文獻】

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本文編號：2701429